1 Introducción
El plegamiento y la estabilidad del ARNt son cruciales para una traducción eficiente, y los defectos en cualquiera de estas propiedades pueden conducir a cantidades reducidas de ARNt, lo que resulta en defectos de crecimiento en la levadura y en enfermedades en los seres humanos (Hopper, 2013; Yarham, Elson, Blakely, McFarland, & Taylor, 2010). En la levadura Saccharomyces cerevisiae, se conocen dos vías principales de control de calidad celular para degradar las especies de ARNt defectuosas. La primera vía es la vía de vigilancia nuclear, que actúa sobre el pre-ARNt en el núcleo mediante el uso del exosoma nuclear y el complejo TRAMP (Kadaba, Wang, & Anderson, 2006; Vanacova et al., 2005) degradando los pre-ARNiMet que carecen de la modificación m1A58 o con un remolque 3′ mal procesado (Ozanick et al., 2009) y una fracción de pre-ARNt de tipo salvaje (WT) (Gudipati et al., 2012). La segunda vía es la vía de la decadencia rápida del ARNt (RTD), que degrada especies específicas de ARNt maduros, hipomodificados o desestabilizados a través de la actividad de las exonucleasas 5′-3′ Rat1 y Xrn1 (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008). La IDT se provoca en mutantes que carecen de alguna de las diversas modificaciones en el cuerpo del ARNt o a través de mutaciones desestabilizadoras, y para todos los sustratos de IDT identificados, la deleción de MET22 restablece completamente los niveles de ARNt y el crecimiento (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe, Whipple, Chernyakov, Jaramillo, & Phizicky, 2012; Guy et al., 2014; Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008; Whipple, Lane, Chernyakov, D’Silva, & Phizicky, 2011). Se presume que la supresión del RTD en las cepas met22Δ se debe a la inhibición de las exonucleasas Rat1 y Xrn1 por el metabolito 3′-fosfoadenosina-5′-fosfato, que tiene niveles aumentados cuando se inhibe Met22 (Dichtl, Stevens, & Tollervey, 1997; Murguia, Belles, & Serrano, 1996).Se sabe que el
RTD actúa sobre varias especies específicas de ARNt, que se han identificado y estudiado utilizando siete enfoques (Fig. 1). El primer enfoque consistió en utilizar microarrays para comparar los niveles de ARNt a escala de todo el genoma en mutantes de modificación sensibles a la temperatura trm8Δ trm4Δ (que carecen de m7G46 y m5C) y en cepas relacionadas en condiciones semipermisivas. De este modo, identificamos el sustrato RTD tRNAVal(AAC), ya que presentaba niveles reducidos de tRNA en el mutante trm8Δ trm4Δ en relación con el WT o los mutantes simples correspondientes (Alexandrov et al., 2006).
Figura 1. Diferentes enfoques utilizados para identificar y analizar los sustratos de RTD.
En el segundo enfoque, se utilizaron northern blots para examinar tanto la tasa como la especificidad de la degradación del ARNt para los sustratos de RTD en los mutantes de modificación sensibles a la temperatura. En este enfoque, se analizó el ARN aislado de las células en diferentes puntos temporales tras el cambio de temperatura para determinar los niveles de ARNt específicos. A partir de este análisis, descubrimos que el 50% del tRNAVal(AAC) se degradaba en un mutante trm8Δ trm4Δ a los 30 minutos de un cambio de 28 a 37 °C, mientras que los tRNAiMet, tRNAMet y tRNAPhe, igualmente hipomodificados, no mostraban ninguna disminución (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008). Además, los niveles relativos de ARNt cargado y no cargado pudieron medirse realizando el northern blot en condiciones ácidas, lo que demostró que los niveles de ARNtVal(AAC) cargado se redujeron en un 50% a los 25 min del cambio de temperatura en un mutante trm8Δ trm4Δ y que los niveles de ARNtVal(AAC) no cargado no parecían afectados (Alexandrov et al, 2006).
El tercer enfoque fue a través de la supresión de ARNt de alta copia, en el que se introdujo un plásmido de alta copia que expresaba un ARNt particular en un mutante de modificación de ARNt sensible a la temperatura. Si el ARNt era un sustrato de RTD y la sensibilidad a la temperatura era el resultado de la degradación de una sola especie de ARNt, entonces la sobreexpresión del ARNt suprimiría el defecto. Así, encontramos que la sensibilidad a la temperatura de un mutante trm8Δ trm4Δ fue suprimida por un plásmido de alta copia que expresaba tRNAVal(AAC), indicando que la sensibilidad a la temperatura se debía principalmente a la pérdida de tRNAVal(AAC), y que las modificaciones que faltaban eran importantes para la estabilidad del tRNA (Alexandrov et al., 2006). De forma similar, los sustratos RTD de varios otros mutantes de modificación de ARNt también se han identificado utilizando este enfoque, incluyendo tRNASer(CGA) y tRNASer(UGA) en los mutantes tan1Δ trm44Δ (que carecen de ac4C12 y Um44) y en los mutantes trm1Δ trm4Δ (que carecen de m2,2G26 y m5C) (Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe et al., 2012; Kotelawala et al., 2008).
En cuarto lugar, utilizamos un enfoque de sustitución genética para identificar los determinantes de la IDT en la familia tRNASer mediante la sustitución del único gen esencial tRNASer(CGA) (SUP61) por diferentes variantes de tRNASer(CGA) en la cepa WT y en la met22Δ, y luego ensayamos el crecimiento a diferentes temperaturas. Utilizando este enfoque, determinamos que las estabilidades combinadas del aceptor y del tallo T eran fuertes determinantes de la susceptibilidad a la IDT en la familia de genes tRNASer(CGA) (Whipple et al., 2011). Esta conclusión fue apoyada además por un quinto enfoque para medir el RTD, en el que demostramos in vitro que las variantes de tRNASer(CGA) que carecían de ac4C12 y Um44, o con mutaciones desestabilizadoras en el tallo aceptor, eran más propensas a la digestión por Xrn1 y más susceptibles a la eliminación del fosfato 5′ por la fosfatasa de ternera (Whipple et al, 2011).
En esta revisión, discutiremos nuestros recientemente desarrollados sexto y séptimo enfoques para el estudio de los sustratos de IDT, que han demostrado ser extremadamente valiosos para ampliar nuestra comprensión de la vía de IDT. El sexto enfoque utiliza un reportero fluorescente para analizar exhaustivamente bibliotecas de miles de variantes de ARNt en cepas WT y met22Δ. A través de este enfoque, hemos identificado 643 posibles sustratos de RTD, muchos de ellos en regiones que no se esperaba que provocaran RTD según trabajos anteriores (Guy et al., 2014). Mostraremos datos que demuestran que este enfoque puede utilizarse para estudiar la función del ARNt bajo diferentes condiciones y discutiremos otras aplicaciones del enfoque.
El séptimo enfoque emplea la extensión del cebador venenoso para medir los niveles de ARNt en una cepa WT y met22Δ y es valioso por su capacidad para medir específicamente una variante de ARNt incluso en presencia del ARNt WT cuya secuencia puede diferir por un solo residuo. Proporcionamos una metodología detallada de este enfoque y discutimos algunas de sus otras posibles aplicaciones.