Cocultivo bacteriano con módulos traductores de señalización celular y controladores de crecimiento para una composición de cultivo regulada de forma autónoma

La tasa de crecimiento celular controlada por la señal AI-1

Primero probamos el control de la tasa de crecimiento celular de E. coli a través de la regulación transcripcional de ptsH, un gen implicado en el transporte de azúcares. HPr (codificada por ptsH) es ampliamente reconocida como una de una serie de proteínas (por ejemplo, E1, HPr, EII) que transfiere secuencialmente un grupo fosforilo de fosfoenolpiruvato (PEP) a glucosa (u otro carbohidrato PTS)34. La HPr está muy conservada37. Recientemente descubrimos que HPr interactúa con la quinasa de la AI-2 LsrK, influyendo en la captación de la AI-235. Aprovechamos la funcionalidad moduladora de la AI-2 más adelante cuando construimos la célula sensora de AI-2. Aquí, demostramos que las cepas mutantes ptsH crecen más lentamente que las cepas de tipo salvaje en medios mínimos que contienen glucosa (Fig. Suplementaria 1a). Cuando se colocó ptsH bajo un promotor inducible por IPTG en un mutante ptsH, la tasa de crecimiento pudo ser controlada en base a la adición de IPTG (Fig. Suplementaria 1b). Es importante destacar que demostramos que la inducción de la expresión de ptsH resulta en un aumento de la tasa de crecimiento celular. Igualmente importante, este comportamiento es independiente de si el medio contiene o no glucosa como fuente principal de carbono (Fig. Suplementaria 1c).

Basado en esta prueba de concepto, a continuación diseñamos la tasa de crecimiento controlada por la señal QS. Para construir la cepa controladora, se colocó ptsH bajo el control del promotor AI-1 lasI QS en el plásmido pAHL-HPr (Fig. 2a) en una cepa mutante ptsH PH04. En otra parte del plásmido, tanto dsRedExpress2, para la visualización celular, como LasR, necesaria para la activación del promotor lasI, se expresaron bajo un promotor T5 constitutivo. La adición de AI-1 a la cepa controladora aumentó la tasa de crecimiento celular hasta 1,8 veces la tasa de crecimiento de referencia de forma dependiente de la dosis (Fig. 2b). La tasa de crecimiento específica medida (entre 1 y 4 h después de la adición de AI-1) sirvió de base para un modelo de tipo Monod de la tasa de crecimiento basado en el nivel de AI-1 (Fig. 2c).

AI-1 modula la composición en los cocultivos de células controladoras

Las células controladoras reguladas por AI-1 se cocultivaron después con otras cepas para verificar que la adición de AI-1 alteraba la composición del cocultivo. Las células controladoras del crecimiento que expresan una proteína roja fluorescente (PH04 pAHL-ptsH) se co-cultivaron con PH04 pCT6 o TOP10 pT5G7. PH04 pCT6 tiene una tasa de crecimiento basal similar a la de PH04 pAHL-ptsH, mientras que TOP10 pT5G crece significativamente más rápido. Los cultivos se inocularon a densidades celulares aproximadamente iguales y se complementaron con niveles variados de AI-1. Tras 8 h, se tomaron muestras para su análisis mediante microscopía de fluorescencia y se cuantificaron con ImageJ. Como se esperaba, cuando las células controladoras se cultivaron con PH04, la composición del cultivo de las células controladoras aumentó con el incremento de la concentración de AI-1 (Fig. 3a). Una tendencia similar se observó cuando las células se cultivaron con TOP10, a pesar de la tasa de crecimiento más rápida de TOP10 (Fig. 3b). Es decir, en los co-cultivos sin AI-1, la fracción de las células controladoras en los co-cultivos de TOP10 en realidad se redujo significativamente del ~0,5 inicial al ~0,09 durante las siguientes 8 h. La adición de AI-1 contrarrestó esa diferencia en la tasa de crecimiento y dio lugar a un mayor nivel de células controladoras durante el mismo período de 8 h. Estos resultados demuestran que, independientemente de otras cepas en el cultivo y de sus respectivas tasas de crecimiento, la IA-1 (que no es una molécula de señalización QS de E. coli) modula la tasa de crecimiento de la cepa controladora diseñada y el cambio se produjo con la suficiente rapidez como para permitir un cambio observable en la composición del cultivo, especialmente incluso en condiciones de lote de duración relativamente corta (a diferencia de los cultivos de lote alimentado, lote repetido o continuo).

A continuación, la cepa controladora regulada por AI-1 se co-cultivó con células que producen AI-1 cuando son inducidas. Se co-cultivaron juntos PH04 pSox-LasI y PH04 pAHL-HPr. El plásmido pSox-LasI contiene lasI, que sintetiza AI-1, bajo el promotor soxS inducible por piocianina7. En este experimento, la cepa controladora recibe una señal de una cepa traductora que, a su vez, produce AI-1 en respuesta a la piocianina. De este modo, se demuestra que el esquema de control de los cocultivos responde a una señal molecular concreta. Aquí, cada cultivo se inoculó a densidades iniciales aproximadamente iguales y los cocultivos se expusieron o no a la piocianina. Los cultivos expuestos mostraron una mayor producción de AI-1 y el correspondiente aumento de la composición de PH04 pAHL-HPr en un plazo de 5 horas (Fig. 3c). Estos resultados demuestran que la AI-1 producida a partir de una cepa alternativa puede modular la tasa de crecimiento de la cepa controladora, y que esto puede ocurrir en las escalas de tiempo necesarias para afectar al cambio en un proceso por lotes. Además, esto demuestra la viabilidad potencial de un co-cultivo regulado por el usuario basado en la aplicación específica de una molécula o inductor, en este caso la piocianina. A continuación, diseñamos la cepa traductora para crear un cocultivo regulado de forma autónoma basado en la molécula de señalización AI-2.

Diseño de células traductoras que detectan AI-2

Para construir líneas celulares que detecten AI-2 y produzcan AI-1, diseñamos cepas para activar la expresión de LasI, que sintetiza AI-1, cuando se activa el promotor AI-2 lsr. Utilizamos un sistema de dos plásmidos para amplificar la expresión del promotor lsr débil25 (Fig. 4a). Brevemente, la AI-2 es fosforilada por LsrK y la AI-2 fosforilada alivia la represión del promotor por LsrR, aumentando la transcripción de los genes transportadores de lsr y acelerando la captación de AI-2. Al mismo tiempo, la activación del promotor de lsr mediada por AI-2 da lugar a la transcripción de la ARN polimerasa T7 del plásmido pCT6 y a la posterior transcripción de lasI del plásmido pET-LasI.

El sistema se construyó por primera vez en la cepa huésped de E. coli CT104, que es un mutante luxS (por ejemplo, incapaz de producir AI-2). CT104 también carece de lsrFG, responsable de degradar la señal fosforilada de AI-2, lo que aumenta la sensibilidad de la célula a la AI-238. Verificamos que esta línea celular, CT104 pCT6 pET-LasI, producía AI-1 cuando se cultivaba en medios condicionados (CM) de BL21 productores de AI-2 (Fig. 2 suplementaria). Las BL21 se cultivaron a diferentes densidades celulares, se recogió el CM y las células CT104 se cultivaron en el CM recogido. Es importante destacar que la AI-1 producida por las células CT104 se correlacionó con la densidad de las células BL21 productoras de AI-2 (Fig. 2a). También probamos si las células traductoras añadidas a consorcios con fracciones variables de células productoras de AI-2 podían producir la señal de AI-1 en función de la composición del consorcio. Se añadieron células CT104 a cultivos con distintas proporciones de BL21 (luxS+) a BL21 ΔluxS. Después de 6 h, el nivel de la señal de AI-1 en el medio extracelular era indicativo de la composición del cultivo, que, a su vez, se basa principalmente en la fracción inicial de células luxS+25 (Fig. suplementaria 2b).

Los experimentos anteriores demostraron que podía construirse una línea celular para producir AI-1 en respuesta a AI-2 a partir de células productoras de AI-2. Estos experimentos se realizaron en medio LB y no en medio con glucosa. La presencia de glucosa inhibe la captación de AI-2 y la actividad del promotor lsr39 y el uso de las células CT104 podría limitarse potencialmente a medios sin glucosa (véase el esquema de la vía de la EQ de la AI-2 en la Fig. 3 suplementaria). Basándonos en el conocimiento del sistema AI-2 QS, intentamos diseñar una cepa que fuera capaz de captar AI-2 y activar el promotor lsr en medios con glucosa. De este modo, nuestros resultados podrían aplicarse de forma más general. Anteriormente, demostramos que HPr (codificada por ptsH) interactúa con LsrK, inhibiendo la actividad quinasa de LsrK, y que se ha demostrado que los mutantes de ptsH captan AI-2 incluso en medios que contienen glucosa35. Por lo tanto, nuestra hipótesis es que el uso de PH04 (ΔptsH ΔluxS) como cepa huésped permitiría la producción de AI-1 basada en AI-2 en medios que contienen glucosa. Probamos las células traductoras utilizando ambas cepas huésped en medios LB y M9 con glucosa con y sin AI-2. El nivel de AI-1 producido dependía de la adición de AI-2, pero también de la cepa huésped y del medio (Fig. 4b). Ambas cepas produjeron AI-1 cuando las células se añadieron a medios LB con AI-2. Como se esperaba, en el medio M9, el uso de la cepa huésped CT104 dio lugar a un pequeño o insignificante cambio de pliegues en la actividad de AI-1 al comparar los cultivos con y sin AI-2. Sin embargo, las células traductoras PH04 mostraron que la AI-2 activaba la producción de AI-1 en medios M9 + glucosa. De este modo, el sistema diseñado podría utilizarse en medios que contienen glucosa.

Caracterización de las células traductoras PH04

Las células traductoras PH04 captan la molécula de señalización AI-2, transducen la señal activando la expresión de LasI y sintetizan y secretan AI-1. La producción deseada de AI-1 es entonces una función de la entrada de AI-2. Hemos caracterizado la producción de AI-1 señalada por AI-2 en la cepa traductora PH04 a lo largo del tiempo y para un rango de concentraciones de AI-2 biológicamente relevantes. La tasa de producción de AI-1 por parte de las células traductoras PH04 resultó ser dependiente de la dosis de AI-2 (Fig. 5a). Observamos que, en estas y otras condiciones similares, la IA-2 se consume en su mayor parte en un plazo de 4 horas (Fig. 5b). La adición de AI-2 o la producción de AI-1 basada en AI-2 en estos cultivos por lotes no produjo una disminución observable del crecimiento celular (Fig. 5c). A continuación, caracterizamos la tasa de producción de AI-1 por célula a lo largo del tiempo para cada concentración de AI-2 probada, trazando una función logística a través de los datos de AI-1, determinando la derivada de esta ecuación a lo largo del tiempo y dividiendo la derivada por la densidad celular a lo largo del tiempo (Tabla Suplementaria 1), obteniendo una tasa de producción específica dependiente del tiempo. Los gráficos resultantes (Fig. 5d) muestran la tasa estimada de producción de AI-1 por célula en función de la adición de AI-2 y del tiempo transcurrido desde la adición de AI-2. Como se mostrará más adelante, esto se alinea con una observación subyacente que hemos observado de que la trayectoria de la expresión génica en respuesta a una señal inicial es bastante robusta21,38,40.

A continuación, se probó el efecto de la AI-1 producida por las células traductoras PH04 sobre la tasa de crecimiento de las células controladoras que responden a la AI-1. Es decir, se añadieron células que responden al crecimiento al CM que contenía AI-1 de las células traductoras que habían sido expuestas a niveles variables de AI-2 y se cultivaron durante ~3 h (Fig. Suplementaria 4a). Más allá de lo mostrado en la Fig. 5, en la que la AI-1 se genera a partir de la exposición directa a la AI-2, este experimento demuestra que la traducción celular de la AI-2 a la AI-1 puede realizarse con la expresión y la dinámica de cultivo celular necesarias para influir en la tasa de crecimiento de la segunda población (Fig. suplementaria 4b). Observamos también que la tasa de crecimiento dinámica de las células controladoras disminuyó en el tiempo durante las 3 horas siguientes. Esta observación se hizo más dramática en experimentos de cocultivo posteriores.

Regulación autónoma de la composición del cocultivo

A continuación añadimos las células traductoras (denominadas población A) y las células controladoras que responden a la IA-1 (población B) a soluciones que tenían un rango de concentraciones iniciales de IA-2. En los cocultivos de células traductoras y células controladoras, las células traductoras regulan de forma autónoma la composición del consorcio en función del nivel inicial de IA-2. En la Fig. 5 suplementaria, los cocultivos con niveles iniciales crecientes de AI-2 dieron lugar a un aumento de AI-1 (Fig. 5b suplementaria) y a un aumento correspondiente de la abundancia relativa de la población B (Fig. 5a suplementaria). Estos resultados demostraron el concepto de control autónomo de la población de consorcios mediado por señales. Es importante destacar que las estimaciones de la tasa de crecimiento para la Población A y la Población B coincidieron con los valores esperados de la tasa de crecimiento medidos durante los experimentos de monocultivo (Fig. Suplementaria 5c).

Entonces, habiendo demostrado que las células traductoras podían regular la composición de los consorcios basándose en la exposición a AI-2, desarrollamos un modelo matemático para caracterizar la dinámica del sistema. De este modo, se puede predecir el comportamiento del cocultivo dadas unas condiciones iniciales específicas, diseños de la tasa de crecimiento, etc., con el fin de determinar los parámetros necesarios para obtener un resultado deseado. Este modelo matemático, conceptualmente sencillo, se creó para predecir el comportamiento del co-cultivo utilizando los datos de las cepas individuales. El modelo consta de cuatro ecuaciones diferenciales ordinarias, una para cada densidad de población, concentración de sustrato y concentración de AI-1 (Tablas suplementarias 2 y 3). Se utilizó la cinética de crecimiento de Monod con un coeficiente de rendimiento constante para modelar el crecimiento celular y la concentración de sustrato, con funciones adicionales que dan cuenta de la producción y/o los efectos de las moléculas de EQ. El AI-1 producido por la población A se basa tanto en el nivel de exposición al AI-2 como en el tiempo (fAI1). En el trabajo anterior38 , descubrimos que las trayectorias del comportamiento celular dependientes del tiempo eran una consecuencia de la exposición inicial al autoinductor, por lo que las funciones dependientes del tiempo de la producción de AI-1 serían plausibles aquí. La tasa de crecimiento de la población B se formuló en función del nivel predominante de AI-1 (fHPr). Las tasas de crecimiento específicas máximas se midieron utilizando datos experimentales, los rendimientos se estimaron basándose en la densidad de la fase estacionaria observada experimentalmente y en las concentraciones iniciales de sustrato conocidas, y los valores K1 y K2 se eligieron basándose en los valores de la literatura para la glucosa. Se utilizó el solucionador ode45 de MATLAB (versión R2016a) para resolver el sistema de EDOs. El modelo puede usarse para mostrar cómo se predice que una población de co-cultivo cambiará con el tiempo dadas estas simples ecuaciones de tasa fenomenológica y las constantes de mejor ajuste. Como se ha señalado, esto proporciona la base para determinar si se puede predecir la evolución de un cocultivo a lo largo de los tiempos limitados disponibles en un cultivo por lotes. Es importante destacar que nuestros resultados de los monocultivos se utilizan para simular los resultados experimentales de los cocultivos.

Es decir, a continuación evaluamos el control de los cocultivos programados de forma autónoma a través de las predicciones del modelo. Los cocultivos de las poblaciones A y B se colocaron juntos para un rango de poblaciones celulares iniciales y luego se añadieron a medios con niveles prescritos de AI-2 con el fin de poner en marcha una trayectoria de la población. En nuestro sistema, la composición inicial se selecciona en función de la proporción de células suministradas en el cocultivo y, a continuación, la composición del cultivo se ajusta de forma autónoma a lo largo del tiempo en función del nivel de AI-2 en los medios. Comparamos los resultados con nuestro modelo. En la Fig. 6, se muestra la composición del co-cultivo y el nivel de AI-1 después de 5 h para una variedad de condiciones que incluyen variadas proporciones iniciales de A:B y el nivel de AI-2. En estas pruebas, utilizamos una densidad celular inicial de la población. Es importante destacar que nuestro modelo predijo bien los resultados experimentales tanto del nivel de AI-1 como de la composición del co-cultivo. También observamos que el modelo puede utilizarse para seleccionar las condiciones iniciales que dan un resultado deseado. Por ejemplo, para conseguir una población B con una densidad celular relativa del 55% a las 5 h, el cocultivo podría iniciarse con una proporción inicial A:B de 60:40 y una concentración de AI-2 de 40 µM. Se probaron y validaron otros escenarios, como se muestra. Estos resultados demuestran claramente que tanto la condición inicial de la composición celular (por ejemplo, la proporción A:B) como la exposición a diferentes niveles de AI-2 influyen en la trayectoria de la población del co-cultivo. Sin embargo, es igualmente importante que la molécula de señal ortogonal, la IA-1, se comporte como se ha modelado. Anticipamos que, por extensión, la inclusión de esta y otras señales traductoras permitirá diseñar y/o controlar otros consorcios más variados o complicados.

Es decir, probamos el sistema de controlador de co-cultivo mediante la exposición a una concentración de AI-2, 80 µM, que era más alta que las concentraciones de AI-2 utilizadas para caracterizar las células traductoras, y para las que no teníamos ningún modelo. Utilizamos los resultados del co-cultivo (Fig. 6) para estimar el comportamiento de las células traductoras en un monocultivo a esta concentración de AI-2. A continuación, realizamos experimentos de monocultivo añadiendo 80 µM de AI-2 a las células traductoras y demostramos que éramos capaces de predecir el comportamiento del monocultivo utilizando los datos del co-cultivo y el modelo. La Fig. 6a muestra la tasa de producción de AI-1 predicha a partir de los datos de co-cultivo y el modelo (línea) y la tasa real de producción de AI-1 durante el experimento de monocultivo (puntos de datos). La Fig. 6b suplementaria muestra los niveles de AI-1 predichos en el monocultivo a lo largo del tiempo en comparación con los niveles reales de AI-1 medidos. El nivel de AI-1 predicho se determinó utilizando el modelo, introduciendo la tasa de producción de AI-1 estimada y la densidad celular inicial del monocultivo.

Por último, probamos nuestro sistema de cocultivo durante un período de tiempo más prolongado utilizando la alimentación por lotes repetida con múltiples adiciones de AI-2 (Fig. 7). Aquí, nuestro objetivo era ampliar la trayectoria de la población más allá de la obtenida variando la composición inicial y la exposición a un nivel fijo de AI-2 en un cultivo por lotes simple. De este modo, probamos la robustez del esquema de control. Por ejemplo, en la Fig. 6, para cultivos inicialmente con un ~40% de población B, descubrimos que sólo podíamos alcanzar niveles de población B que se acercaran al 60% y sólo mediante la exposición a niveles altos (>80 μM) de AI-2. Al probar un sistema de lotes repetidos, pensamos que podíamos llevar la población B a más del 80% simplemente resuspendiendo y extendiendo el sistema en el tiempo. Añadimos nuestro co-cultivo a medios con niveles variados de AI-2 y cada 3 h resuspendimos las células en medios frescos con AI-2 adicional. Inmediatamente antes de cada resuspensión, se tomaron muestras para analizar la concentración de AI-1 y la composición del cultivo celular (Fig. 7a, b). También se midieron la densidad celular y la actividad de AI-2 (Fig. 7 suplementaria). Comprobamos que en este montaje experimental más complejo, el sistema funcionaba en general como se había diseñado. Encontramos que mediante la exposición a cantidades menores de AI-2 (20 y 40 μM), podíamos alcanzar casi el 80% de la población B. Durante esta prueba, sin embargo, encontramos que nuestros resultados experimentales divergían de los resultados predichos por nuestro modelo matemático. Examinamos más detenidamente la IA-1 producida y la tasa de crecimiento de los cultivos durante cada segmento de 3 h para comprender la dinámica del cultivo basándonos en la divergencia observada con el modelo simple. Por ejemplo, la IA-1 producida durante el segundo y el tercer ciclo de 3 horas fue superior a la prevista por el modelo. En retrospectiva, esto tenía sentido porque las células, después del primer ciclo del lote, ya habían producido LasI (que sintetiza AI-1), y la AI-2 adicional probablemente estaba induciendo una mayor producción de LasI (no incluimos una etiqueta de degradación en LasI, por lo que su mantenimiento debería haberse anticipado). A continuación, ajustamos el modelo para que la tasa de producción de AI-1 al principio de cada resuspensión posterior en un nuevo medio fuera la misma que al final del ciclo anterior (Fig. 7c, líneas sólidas). La incorporación de estas nuevas funciones para la producción de AI-1 en el modelo dio como resultado valores para la AI-1 que se ajustan estrechamente a los datos experimentales de AI-1 (Fig. 7a, modelo en líneas sólidas). De forma similar, estimamos la tasa de crecimiento de las células controladoras (véase la Nota Suplementaria 1) y descubrimos que la tasa de crecimiento en combinación con las concentraciones de AI-1 no se ajustaba a nuestra función fAI1 anterior (Fig. 7d). Observamos que para calcular la tasa de crecimiento de las células controladoras asumimos que la tasa de crecimiento de las células traductoras se mantuvo constante, aunque pueden haber disminuido ligeramente como resultado de las repetidas adiciones de AI-2. Aunque la tasa de crecimiento de las células controladoras pareció aumentar inicialmente en función de la IA-1, con las subsiguientes resuspensiones en medio fresco la tasa de crecimiento global disminuyó. Anteriormente habíamos observado una disminución dinámica de la tasa de crecimiento tras la sobreexpresión de HPr y LasI (Figs. suplementarias 4 y 5). En este caso, sospechamos que una carga metabólica impuesta a las células por la exposición repetida a altos niveles de AI-1 o la reducción de los niveles de sustrato o nutrientes podrían haber sido las causas de la disminución del crecimiento durante los últimos ciclos. Es importante destacar que al ajustar nuestro modelo para que el efecto de la IA-1 en la tasa de crecimiento disminuyera con el tiempo (véase la Nota complementaria 2), pudimos ajustar nuestros datos experimentales (Fig. 7b, modelo ajustado en líneas sólidas) sin añadir complejidad al modelo.

En resumen, nuestro sistema de co-cultivo respondió como se diseñó si se colocó en medios sin AI-2 o con un alto nivel de AI-2. Además, nuestros resultados mostraron densidades de población controlables que abarcaban del 40 al 80% de las células controladoras. Asimismo, la comparación con nuestro modelo original permitió comprender cómo se comportaba el sistema en este montaje experimental más complejo; las células traductoras parecían producir niveles más altos de AI-1 a lo largo del tiempo, mientras que las células controladoras parecían haber reducido los cambios regulados por la AI-1 en la tasa de crecimiento a lo largo del tiempo.

Por último, el modelo podría proporcionar una base para explorar in silico cómo las estrategias utilizadas aquí para los cultivos regulados de forma autónoma (marcados por la tasa de crecimiento regulada por señales y la señalización nativa célula-célula) podrían extenderse a otros sistemas, incluidos los sistemas regulados por el usuario o programables que podrían ser controlados dinámicamente. Por ejemplo, los cultivos en quimiostatos se distinguen del sistema autónomo actual en que sus salidas están dirigidas por entradas especificadas por el usuario, como la tasa de dilución. Como primer paso, realizamos simulaciones de cocultivos en quimiostatos añadiendo los términos de flujo estándar al modelo por lotes (Fig. 8 y Tablas 4 y 5 suplementarias). En algunos casos, encontramos que la tasa de dilución define la composición del cultivo en estado estacionario que, a su vez, puede ser «ajustada» dentro de un rango limitado por la tasa de dilución. El «ajuste» puede lograrse modulando externamente la señalización célula-célula, por ejemplo, mediante la adición exógena de moléculas de señalización. Estos casos ilustran cómo la interacción entre nuestro sistema autónomo y otros sistemas controlados por el usuario puede conducir a trayectorias poblacionales más complejas. Los resultados de nuestra simulación sirven como marco conceptual para controlar la composición de los consorcios en sistemas más complejos y controlados por el usuario. Para más información sobre las simulaciones de quimiostatos, véase la Nota complementaria 3.