Cystinový transport a cystinosin
Cystin se hromadí v lysozomech cystinotických leukocytů14 a fibroblastů.44 Chlorochin a další inhibitory degradace lysozomálních proteinů tlumí opětovnou akumulaci cystinu v depletovaných cystinotických buňkách, což naznačuje, že zdrojem přebytečného cystinu je intracelulární degradace proteinů45. Obsah cystinu v normálních a cystinotických buňkách lze také zvýšit zatížením dimethylesterem cystinu46 nebo směsným disulfidem cysteinu a glutathionu44; zejména je však v cystinotických buňkách zatížených cystinem výrazně narušen únik cystinu z lysosomů44,46 . Vyplavování cystinu z buněk odvozených od heterozygotních nositelů genu pro nefropatickou cystinózu není ve srovnání s buňkami divokého typu výrazně narušeno44. Měření kontratransportu cystinu a cystinu v lysozomálních granulích však jasně prokazuje jeho absenci u homozygotních pacientů, přičemž hodnoty u heterozygotních nosičů jsou přibližně poloviční oproti normálním kontrolním buňkám47; defektní lysozomální transport cystinu je tedy příčinnou poruchy cystinózy.
Biochemická diagnostika pacientů48 i heterozygotních nosičů49 byla rozhodující pro přesné zmapování genu pro cystinózu na chromozomu 17p13. Klíčovým průlomem byla detekce genomových delecí pro spojený mikrosatelitní marker, po níž následovala identifikace genu CTNS v minimálním delečním intervalu.50 Gen CTNS se skládá z 12 exonů a kóduje protein o 367 aminokyselinách zvaný cystinosin. Cystinosin se skládá ze sedmi transmembránových domén, N-konce o 128 aminokyselinách, který obsahuje sedm glykosylačních míst, a C-konce o 10 aminokyselinách. Zdá se, že všichni pacienti s různými podtypy cystinózy mají mutaci v genu CTNS (tj. zatím není prokázána genetická heterogenita). Nejčastější mutací je delece o velikosti 57 kb, která přesouvá 5′ oblast před exon 1051,52; více než 70 % pacientů s nefropatickou cystinózou severoevropského původu je pro tuto mutaci homozygotních.52-54 Bendavid a jeho kolegové vyvinuli fluorescenční in situ hybridizační sondy pro tuto velkou deleci, první svého druhu pro lysozomální střádavou poruchu.55 Samostatné mutace s předpokládaným efektem zakladatele byly identifikovány ve francouzské Kanadě56 (W138X, irského původu) a ve francouzské provincii Bretaň57 (splice-site mutace na konci exonu 8). Jedna rekurentní missense mutace (G339R) byla identifikována ve dvou konkrétních etnických populacích: ve dvou nepříbuzných rodinách amišsko-menonitského původu a v pěti nepříbuzných rodinách židovsko-marockého původu.58-61 Bylo také identifikováno dalších 50 mutací CTNS, včetně nejméně tří pacientů s mutacemi v promotorové oblasti genu.62 Pacienti s juvenilní nebo oční cystinózou jsou homozygoti pro „mírnější“ mutaci, obvykle bodovou mutaci bez narušení otevřeného čtecího rámce; případně jsou tito pacienti složení heterozygoti pro mírnou mutaci a závažnější mutaci.17,59
Cystinosin je široce exprimován, s obzvláště hojným přepisem v pankreatu, svalech a ledvinách.50 Imunohistochemie s anticystinosinovými protilátkami63 a transfekce buněk s komplementární DNA (cDNA) označenou epitopem64,65 odhaluje, že protein je exprimován v lysozomech. Podle očekávání je exprese cystinosinu zvláště silná v proximálním tubulu ledviny.63 Lokalizace cystinosinu do lysozomální membrány je závislá jak na tyrosinovém lysozomálním třídicím motivu GYDQL umístěném na C-koncovém ocasu, tak na pentapeptidu YFPQA v páté intertransmembránové smyčce. Motiv YFPQA je poněkud unikátní v tom, že je vzácným příkladem lysosomálního třídicího signálu umístěného mimo cytoplazmatický ocas.64 Zdá se, že vykazuje určitou schopnost zachránit třídění cystinosinu sám o sobě, vzhledem k tomu, že mutant cystinosinu s chybějícím motivem GYDQL, ale neporušeným motivem YFPQA se stále částečně lokalizuje do lysosomů.65 Menší část mutací cystinosinu ovlivňuje lysosomální cílení cystinosinu v důsledku primárního narušení motivu GYDQL nebo dosud nepopsaných účinků na sekundární strukturu.66
Funkční charakterizace cystinosinu využila přesměrování proteinu na plazmatickou membránu u mutanta, cystinosin-.GYDQL, který postrádá C-terminální motiv GYDQL.67 Cystinosin-.GYDQL tak funguje jako H+ řízený transportér cystinu na plazmatické membráně transfekovaných buněk. Je vysoce specifický pro L-cystin; ostatní aminokyseliny, zejména monosulfid cystein, nejsou substráty. Cystinosin je nasytitelný a řídí se Michaelis-Mentonovou kinetikou, přičemž Km pro cystin je ∼280 μM.67 Transport dovnitř je výrazně stimulován kyselým extracelulárním pH (obr. 14-6); zhroucení tohoto transmembránového gradientu H+ přídavkem nigericinu transport zruší, což odpovídá kotransportu H+-cystinu cystinosinem. Lysozomální transport cystinu je zase závislý na přítomnosti adenosintrifosfátu (ATP), který pohání lysozomální H+-ATPázu a řídí eflux cystinu (obr. 14-7).46,68,69
Konstrukt cystinosin-.GYDQL byl využit pro funkční charakterizaci chybějících mutací cystinosinu spojených s onemocněním. Z větší části korelují transportní a klinické fenotypy, přičemž zrušení transportu mutacemi spojenými s nefropatickou cystinózou a reziduální funkci zprostředkovávají konstrukty exprimující mutace spojené s juvenilním a očním podtypem onemocnění.66 Některé mutace spojené s juvenilní cystinózou však ruší transport v kontextu cystinosin-.GYDQL, což naznačuje, že tyto mutace mají menší vliv na cystinosin plné délky exprimovaný v lysozomálních membránách; jednou z možností je, že cystinosin interaguje s lysozomálními proteiny, které stabilizují tyto konkrétní mutantní formy.66 Dochází také k opačnému jevu, takže některé mutace nefropatické cystinózy mají minimální vliv na transport zprostředkovaný cystinosinem-.GYDQL.66
Cílená delece cystinosinu u myší vede k akumulaci cystinu v mnoha orgánech, včetně ledvin.70 Fokální depozita krystalů cystinu lze detekovat v několika tkáních, včetně v buňkách proximálních tubulů. Tyto myši však nevykazují proximální tubulopatii, což naznačuje, že samotná akumulace krystalů cystinu není příčinou onemocnění.70 Oční anomálie u myší s deficitem cystinosinu jsou však velmi podobné pacientům s cystinózou. U těchto zvířat se tedy objevují ložiska krystalů cystinu na rohovce a depigmentované skvrny na sítnici, což svědčí o retinopatii.70