Bakteriel samkultur med cellesignal-oversætter og vækstreguleringsmoduler til autonomt reguleret kultursammensætning

AI-1-signal kontrolleret cellevæksthastighed

Vi testede først E. coli-cellevæksthastighedskontrol gennem transkriptionel regulering af ptsH, et gen, der er involveret i sukkertransport. HPr (kodet af ptsH) er almindeligt anerkendt som et af en række proteiner (f.eks. E1, HPr, EII), der sekventielt overfører en fosforylgruppe fra phosphoenolpyruvat (PEP) til glukose (eller et andet PTS-kulhydrat)34. HPr er meget bevaret37. Vi opdagede for nylig, at HPr interagerer med AI-2-kinasen LsrK og påvirker optagelsen af AI-235. Vi udnyttede den AI-2-modulerende funktionalitet senere, da vi konstruerede AI-2-sensorcellen. Her viste vi, at ptsH-mutantstammer vokser langsommere end vildtypestammer i minimalt medie indeholdende glukose (Supplerende figur 1a). Da ptsH blev placeret under en IPTG-inducerbar promotor i en ptsH-mutant, kunne væksthastigheden styres på grundlag af IPTG-tilsætning (Supplerende fig. 1b). Det er vigtigt, at vi påviste, at induktion af ekspression af ptsH resulterer i en stigning i cellevæksthastigheden. Lige så vigtigt er det, at denne adfærd er uafhængig af, om medierne indeholder glukose som den vigtigste kulstofkilde eller ej (Supplerende fig. 1c).

Baseret på dette proof of concept konstruerede vi dernæst QS-signalstyret væksthastighed. For at konstruere den kontrollerende stamme blev ptsH placeret under kontrol af AI-1 lasI QS promotoren på plasmidet pAHL-HPr (Fig. 2a) i en ptsH mutant stamme PH04. Andetsteds på plasmidet blev både dsRedExpress2, til cellevisualisering, og LasR, der er nødvendig for lasI-promotoraktivering, udtrykt under en konstitutiv T5-promotor. Tilsætning af AI-1 til controller-stammen øgede cellevæksthastigheden op til 1,8 gange basisvæksthastigheden på en dosisafhængig måde (fig. 2b). Den målte specifikke vækstrate (mellem 1 og 4 timer efter tilsætning af AI-1) tjente som grundlag for en model af Monod-typen for vækstrate baseret på AI-1-niveauet (fig. 2c).

AI-1 modulerer sammensætningen i controllercellers samkulturer

De AI-1-regulerede controllerceller blev derefter samdyrket med andre stammer for at verificere, at tilsætning af AI-1 ændrede sammensætningen af samkulturen. Vækstreguleringsceller, der udtrykker et rødt fluorescerende protein (PH04 pAHL-ptsH), blev co-kultureret med enten PH04 pCT6 eller TOP10 pT5G7. PH04 pCT6 har en lignende basisvæksthastighed som PH04 pAHL-ptsH, mens TOP10 pT5G vokser betydeligt hurtigere. Kulturerne blev inokuleret ved omtrent samme celletætheder og suppleret med forskellige AI-1-niveauer. Efter 8 timer blev der udtaget prøver til analyse ved hjælp af fluorescensmikroskopi og kvantificeret ved hjælp af ImageJ. Som forventet steg kultursammensætningen af controllercellerne, når de blev dyrket med PH04, med stigende AI-1-koncentration (fig. 3a). En lignende tendens blev set, når cellerne blev dyrket med TOP10, på trods af TOP10’s hurtigere væksthastighed (fig. 3b). Det vil sige, at i samkulturer uden AI-1 faldt andelen af controllerceller i TOP10-samkulturerne faktisk betydeligt fra de oprindelige ~0,5 til ~0,09 i løbet af de efterfølgende 8 timer. Tilsætning af AI-1 modvirkede denne forskel i vækstrate og resulterede i et højere niveau af controllerceller i den samme 8-timers periode. Disse resultater viser, at uanset andre stammer i kulturen og deres respektive vækstrater, modulerer AI-1 (som ikke er et E. coli QS-signalmolekyle) væksthastigheden for den manipulerede controller-stamme, og ændringen skete tilstrækkeligt hurtigt til at muliggøre en observerbar ændring i kulturens sammensætning – især selv under relativt kortvarige batchbetingelser (i modsætning til fed-batch, gentagne batch- eller kontinuerlige kulturer).

Dernæst blev den AI-1-regulerede controller-stamme samdyrket med celler, der producerer AI-1, når den er induceret. PH04 pSox-LasI og PH04 pAHL-HPr blev samdyrket sammen. Plasmidet pSox-LasI indeholder lasI, som syntetiserer AI-1, under den pyocyanin-inducerbare soxS promotor7. I dette forsøg modtager controller-stammen et signal fra en translater-stamme, der til gengæld producerede AI-1 som reaktion på pyocyanin. På denne måde er det vist, at samkulturkontrolordningen reagerer på et bestemt molekylært signal. Her blev hver kultur inokuleret med omtrent samme starttætheder, og samkulturerne blev enten udsat for pyocyanin eller ej. Eksponerede kulturer viste en øget produktion af AI-1 og en tilsvarende øget sammensætning af PH04 pAHL-HPr inden for 5 timer (fig. 3c). Disse resultater viser, at AI-1 produceret fra en alternativ stamme kan modulere væksthastigheden for den kontrollerende stamme, og at dette kan ske på de tidshorisonter, der er nødvendige for at påvirke ændringer i en batchproces. Desuden viser dette, at det er muligt at gennemføre en brugerreguleret samkultur baseret på en brugerspecifik anvendelse af et molekyle eller en inducer, i dette tilfælde pyocyanin. Vi konstruerede derefter translatorstammen til at skabe en autonomt reguleret samkultur baseret på det gennemtrængende AI-2-signalmolekyle.

Design af AI-2-sensorerende translatorceller

For at konstruere cellelinjer, der registrerer AI-2 og producerer AI-1, konstruerede vi stammer til at aktivere ekspression af LasI, som syntetiserer AI-1, når AI-2 lsr-promotoren aktiveres. Vi brugte et system med to plasmider til at forstærke ekspressionen fra den svage lsr-promotor25 (Fig. 4a). Kort fortalt fosforyleres AI-2 af LsrK, og fosforyleret AI-2 ophæver repressionen af promotoren af LsrR, hvilket øger transkriptionen af lsr-transportergenerne og fremskynder AI-2-optagelsen. Samtidig resulterer AI-2-medieret aktivering af lsr-promotoren i transkription af T7 RNA-polymerase fra plasmidet pCT6 og efterfølgende transkription af lasI fra plasmidet pET-LasI.

Systemet blev først konstrueret i E. coli-værtsstammen CT104, som er en luxS-mutant (f.eks. ude af stand til at producere AI-2). CT104 mangler også lsrFG, der er ansvarlig for nedbrydning af det fosforylerede AI-2-signal, hvilket øger cellens følsomhed over for AI-238. Vi verificerede, at denne cellelinje, CT104 pCT6 pET-LasI, producerede AI-1, når den blev dyrket i konditioneret medie (CM) fra AI-2 producerende BL21 (Supplerende figur 2). BL21 blev dyrket til varierende celletætheder, CM blev opsamlet, og CT104-celler blev dyrket i det opsamlede CM. Det er vigtigt at bemærke, at AI-1 produceret af CT104-cellerne korrelerede med tætheden af de AI-2 producerende BL21-celler (supplerende fig. 2a). Vi testede også, om translatorceller, der blev tilføjet til konsortier med varierende fraktioner af AI-2 producerende celler, kunne producere AI-1-signalet baseret på konsortiets sammensætning. CT104-celler blev tilsat til kulturer med varierende forhold mellem BL21 (luxS+) og BL21 ΔluxS. Efter 6 timer var niveauet af AI-1-signalet i de ekstracellulære medier indikativt for kultursammensætningen, som igen primært er baseret på den oprindelige fraktion af luxS+-celler25 (Supplerende fig. 2b).

Overstående forsøg viste, at der kunne konstrueres en cellelinje til at producere AI-1 som respons på AI-2 fra AI-2 producerende celler. Disse eksperimenter blev udført i LB-medier og ikke i medier med glukose. Tilstedeværelsen af glukose hæmmer optagelsen af AI-2 og lsr-promotoraktivitet39 , og brugen af CT104-cellerne kunne potentielt begrænses til medier uden glukose (se supplerende fig. 3 for skema over AI-2 QS-banen). På baggrund af kendskabet til AI-2 QS-systemet forsøgte vi at konstruere en stamme, der var i stand til at optage AI-2 og aktivere lsr-promotoren i glucoseholdige medier. På denne måde kunne vores resultater anvendes mere generelt. Vi har tidligere vist, at HPr (kodet af ptsH) interagerer med LsrK og hæmmer LsrK-kinaseaktiviteten, og at ptsH-mutanter har vist sig at optage AI-2 selv i glucoseholdige medier35. Vi antog derfor, at brugen af PH04 (ΔptsH ΔluxS) som værtsstamme ville give mulighed for AI-2-baseret produktion af AI-1 i glucoseholdige medier. Vi testede translatorcellerne ved hjælp af begge værtsstammer i LB- og M9-glukosemedier med og uden AI-2. Niveauet af AI-1 produceret var afhængig af tilsætningen af AI-2, men også af værtsstammen og mediet (Fig. 4b). Begge stammer producerede AI-1, når cellerne blev tilsat til LB-medier med AI-2. Som forventet resulterede anvendelsen af CT104-værtsstammen i M9-medier i en lille eller ubetydelig foldændring i AI-1-aktivitet, når man sammenlignede kulturer med og uden AI-2. Det er vigtigt at bemærke, at PH04-oversættercellerne imidlertid viste AI-2 aktiveret produktion af AI-1 i M9 + glukose-medier. På denne måde kunne det konstruerede system anvendes i glucoseholdige medier.

Karakterisering af PH04-oversætterceller

PH04-oversætterceller optager AI-2-signalmolekylet, transducerer signalet ved at aktivere ekspression af LasI og syntetiserer og udskiller AI-1. Det ønskede AI-1 output er derefter en funktion af AI-2 input. Vi har karakteriseret den AI-2-signalede produktion af AI-1 i PH04-translatorstammen over tid og for en række biologisk relevante AI-2-koncentrationer. Hastigheden af AI-1-produktion af PH04-oversættercellerne viste sig at være dosisafhængig af AI-2 (fig. 5a). Vi bemærker, at under disse og lignende betingelser forbruges AI-2 for det meste inden for 4 timer (Fig. 5b). Tilsætning af AI-2 eller AI-2-baseret produktion af AI-1 i disse batchkulturer resulterede ikke i noget observerbart fald i cellevæksten (Fig. 5c). Vi karakteriserede derefter hastigheden af AI-1-produktionen pr. celle over tid for hver testet AI-2-koncentration ved at plotte en logistisk funktion gennem AI-1-dataene, bestemme den afledte af denne ligning over tid og dividere den afledte af celletætheden over tid (Supplerende tabel 1), hvilket giver en tidsafhængig specifik produktionshastighed. De resulterende plotter (fig. 5d) viser den anslåede AI-1-produktionshastighed pr. celle som en funktion af tilsat AI-2 og tiden fra tilsætningen af AI-2. Som det vil blive vist senere, stemmer dette overens med en underliggende observation, som vi har observeret, nemlig at banen for genekspression som svar på et indledende cue er ret robust21,38,40.

Næst blev virkningen af AI-1 produceret af PH04-oversættercellerne på væksthastigheden for de AI-1-responsive controllerceller testet. Det vil sige, at vækstresponsive celler blev tilsat CM indeholdende AI-1 fra translatorceller, der var blevet eksponeret for varierende niveauer af AI-2, og dyrket i ~3 h (Supplerende figur 4a). Ud over det, der blev vist i fig. 5, hvor AI-1 genereres fra direkte eksponering for AI-2, viser dette eksperiment, at celleoversættelsen af AI-2 til AI-1 kan ske med den nødvendige ekspression og cellekulturdynamik, således at væksthastigheden for den anden population påvirkes (Supplerende fig. 4b). Vi bemærker også, at den dynamiske væksthastighed for controllercellerne viste sig at falde i tid i løbet af de efterfølgende 3 timer. Denne observation blev gjort mere dramatisk i senere samkulturforsøg.

Autonom regulering af samkulturens sammensætning

Vi tilføjede herefter translatorcellerne (benævnt Population A) og de AI-1-responsive controllerceller (Population B) til opløsninger med en række indledende AI-2-koncentrationer. I samkulturer af translatorceller og controllerceller regulerer translatorcellerne autonomt konsortiets sammensætning baseret på det oprindelige AI-2 niveau. I supplerende figur 5 resulterede samkulturer med øgede indledende AI-2 niveauer i en stigning i AI-1 (supplerende figur 5b) og en tilsvarende stigning i den relative hyppighed af Population B (supplerende figur 5a). Disse resultater viste konceptet med signalformidlet autonom kontrol af konsortiepopulationen. Det er vigtigt, at estimater af vækstrate for Population A og Population B stemte overens med forventede værdier for vækstrate målt under monokulturforsøg (Supplerende Fig. 5c).

Så, efter at have demonstreret, at translatorceller kunne regulere konsortiersammensætningen baseret på eksponering for AI-2, udviklede vi en matematisk model til at karakterisere systemdynamikken. På denne måde kan man forudsige samkulturadfærd givet specifikke startbetingelser, væksthastighedsdesigns osv. med henblik på at bestemme de parametre, der er nødvendige for at målrette et ønsket output. Denne begrebsmæssigt enkle matematiske model blev skabt til at forudsige samkulturens adfærd ved hjælp af data fra de enkelte stammer. Modellen består af fire ordinære differentialligninger, én for hver populationstæthed, substratkoncentration og AI-1-koncentration (Supplerende tabeller 2 og 3). Monod-vækstkinetik med en konstant udbyttekoefficient blev anvendt til at modellere cellevækst og substratkoncentration, med yderligere funktioner, der tager højde for produktionen og/eller virkningerne af QS-molekylerne. Den AI-1, der produceres af population A, er baseret både på niveauet af AI-2 eksponering og tiden (fAI1). I det tidligere arbejde38 fandt vi, at tidsafhængige baner for celleadfærd var en konsekvens af den indledende eksponering for autoinducer, så tidsafhængige funktioner for AI-1-produktion ville være plausible her. Væksthastigheden for Population B blev formuleret på grundlag af det fremherskende niveau af AI-1 (fHPr). Den maksimale specifikke væksthastighed blev målt ved hjælp af eksperimentelle data, udbyttet blev anslået på grundlag af eksperimentelt observeret stationærfasetæthed og kendte indledende substratkoncentrationer, og K1- og K2-værdierne blev valgt på grundlag af litteraturværdier for glukose. MATLAB (version R2016a) ode45-løseren blev anvendt til at løse systemet af ODE’er. Modellen kan bruges til at vise, hvordan en samkulturpopulation forudsiges at ændre sig med tiden i betragtning af disse enkle fænomenologiske hastighedsligninger og best-fit-konstanter. Som nævnt danner dette grundlag for at afgøre, om en samkultur overhovedet kan forudsiges at udvikle sig i løbet af den begrænsede tid, der er til rådighed i en batchkultur. Det er vigtigt, at vores resultater fra monokulturer bruges til at simulere eksperimentelle resultater fra samkulturer.

Det vil sige, at vi derefter evaluerede autonomt programmeret samkulturstyring via modelforudsigelser. Co-kulturer af populationer A og B blev placeret sammen for en række indledende cellepopulationer og blev derefter tilsat medier med foreskrevne niveauer af AI-2 for at sætte en populationsbane i gang. I vores system vælges den oprindelige sammensætning på grundlag af forholdet mellem de celler, der tilføres i samkulturen, og derefter justeres kultursammensætningen autonomt over tid på grundlag af AI-2-niveauet i mediet. Vi sammenlignede resultaterne med vores model. I fig. 6 er samkulturens sammensætning og AI-1-niveauet efter 5 timer vist for en række forskellige betingelser, herunder varierede indledende A:B-forhold og AI-2-niveau. I disse forsøg anvendte vi én indledende population celletæthed. Det er vigtigt at bemærke, at vi fandt, at vores model forudsagde de eksperimentelle resultater af både AI-1-niveauet og samkulturens sammensætning godt. Vi bemærker også, at modellen kan bruges til at vælge indledende betingelser, der giver et ønsket resultat. For eksempel kan man for at opnå en Population B med en relativ celletæthed på 55 % efter 5 timer starte samdyrkningen med et indledende A:B-forhold på 60:40 og en AI-2-koncentration på 40 µM. Andre scenarier blev afprøvet og valideret som vist. Disse resultater viser klart, at den indledende betingelse for cellesammensætningen (f.eks. forholdet mellem A:B) og eksponeringen for forskellige niveauer af AI-2 begge påvirker samkulturpopulationens forløb. Lige så vigtigt er det imidlertid, at det ortogonale signalmolekyle, AI-1, opførte sig som modelleret. Vi forventer, at inddragelse af dette og andre translatorsignaler i forlængelse heraf vil gøre det muligt at udforme og/eller kontrollere yderligere, varierede eller mere komplicerede konsortier.

Det vil sige, at vi testede samkulturstyringssystemet ved at udsætte det for en AI-2-koncentration, 80 µM, der var højere end de AI-2-koncentrationer, der blev brugt til at karakterisere translatorcellerne, og som vi ikke havde nogen model for. Vi brugte resultaterne af samkulturen (fig. 6) til at estimere translatorcellers adfærd i en monokultur ved denne AI-2-koncentration. Vi udførte derefter monokulturforsøg ved at tilsætte 80 µM AI-2 til translatorceller og viste, at vi var i stand til at forudsige monokulturadfærd ved hjælp af samkulturdataene og modellen. Supplerende figur 6a viser den AI-1-produktionshastighed, der er forudsagt ud fra samkulturdataene og modellen (linje), og den faktiske AI-1-produktionshastighed under monokulturforsøget (datapunkter). Supplerende fig. 6b viser de forudsagte AI-1-niveauer i monokulturen over tid sammenlignet med de faktisk målte AI-1-niveauer. Det forudsagte AI-1-niveau blev bestemt ved hjælp af modellen ved at indtaste den anslåede AI-1-produktionshastighed og monokulturens oprindelige celletæthed.

Sidst testede vi vores samdyrkningssystem over en mere langvarig periode ved hjælp af gentagen batchfodring med flere AI-2-tilsætninger (fig. 7). Her var vores mål at udvide populationsbanen ud over den, der blev opnået ved at variere den oprindelige sammensætning og eksponering for et fast AI-2 niveau i en simpel batchkultur. På denne måde testede vi kontrolsystemets robusthed. For eksempel fandt vi i fig. 6 for kulturer, der oprindeligt havde ~40 % population B, at vi kun kunne opnå niveauer af population B, der nærmede sig 60 %, og kun ved at udsætte dem for høje niveauer (>80 μM) af AI-2. Ved at afprøve et gentaget batch-system troede vi, at vi kunne drive B-populationen til over 80% ved blot at genudsætte og forlænge systemet i tid. Vi tilføjede vores samkultur til medier med varierende niveauer af AI-2, og hver 3. time resuspenderede vi cellerne i friske medier med yderligere AI-2. Umiddelbart før hver resuspension blev der taget prøver til analyse af AI-1-koncentrationen og cellekulturens sammensætning (fig. 7a, b). Celletæthed og AI-2 aktivitet blev også målt (supplerende fig. 7). Vi fandt, at i denne mere komplekse forsøgsopstilling fungerede systemet generelt som planlagt. Vi fandt, at vi ved eksponering for mindre mængder AI-2 (20 og 40 μM) kunne opnå næsten 80 % population B. Under denne test fandt vi imidlertid, at vores eksperimentelle resultater afveg fra de resultater, der var forudsagt af vores matematiske model. Vi kiggede nærmere på den producerede AI-1 og kulturernes væksthastighed i hvert 3-h-segment for at få en forståelse af kulturdynamikken på baggrund af den observerede divergens med den simple model. F.eks. var den AI-1, der blev produceret i løbet af den anden og tredje 3 timers cyklus, højere end forudsagt af modellen. Set i bakspejlet gav dette mening, fordi cellerne efter den første batchcyklus allerede havde produceret LasI (som syntetiserer AI-1), og den yderligere AI-2 inducerede sandsynligvis yderligere produktion af LasI (vi inkluderede ikke et nedbrydningsmærke på LasI, så dets vedligeholdelse burde have været forventet). Vi justerede derefter modellen, så AI-1-produktionshastigheden i begyndelsen af hver efterfølgende resuspension i nye medier var den samme som i slutningen af den foregående cyklus (Fig. 7c, gennemgående linjer). Indarbejdelsen af disse nye funktioner for AI-1-produktion i modellen resulterede i værdier for AI-1, der passede nøje til de eksperimentelle AI-1-data (Fig. 7a, model i gennemgående linjer). På samme måde estimerede vi væksthastigheden for controllercellerne (se supplerende note 1) og fandt, at væksthastigheden i kombination med AI-1-koncentrationerne ikke passede til vores tidligere fAI1-funktion (fig. 7d). Vi bemærker, at vi for at beregne væksthastigheden for controllercellerne antog, at væksthastigheden for translatorcellerne forblev konstant, selv om de kan være faldet en smule som følge af gentagne AI-2-tilsætninger. Mens controller-væksthastigheden i begyndelsen syntes at stige som funktion af AI-1, faldt den samlede væksthastighed ved efterfølgende resuspenderinger i friske medier. Vi havde tidligere bemærket et dynamisk fald i væksthastigheden ved overekspression af HPr og LasI (Supplerende figurer 4 og 5). Her mistænker vi, at enten en metabolisk belastning af cellerne som følge af gentagen eksponering for høje niveauer af AI-1 eller reducerede substrat- eller næringsstofniveauer kan have været årsag til den nedsatte vækst i de senere cyklusser. Det er vigtigt, at vi ved at justere vores model, så effekten af AI-1 på væksthastigheden faldt med tiden (se supplerende note 2), var vi i stand til at passe til vores eksperimentelle data (Fig. 7b, justeret model i faste linjer) uden at tilføje modelkompleksitet.

I alt reagerede vores samdyrkningssystem som planlagt, uanset om det blev placeret i medier uden AI-2 eller med et højt niveau af AI-2. Desuden viste vores resultater kontrollerbare populationstætheder, der strakte sig over 40 til 80 % af de kontrollerende celler. Desuden gav sammenligning med vores oprindelige model indsigt i, hvordan systemet opførte sig i denne mere komplekse eksperimentelle opsætning; translatorcellerne syntes at producere højere niveauer af AI-1 over tid, mens controllercellerne syntes at have reducerede AI-1-regulerede ændringer i væksthastighed over tid.

Endeligt kan modellen give et grundlag for at udforske in silico, hvordan de strategier, der anvendes her til autonomt regulerede kulturer (præget af signalreguleret væksthastighed og native celle-celle-signalering), kan udvides til andre systemer, herunder brugerregulerede eller programmerbare systemer, der kan styres dynamisk. Kemostatkulturer adskiller sig f.eks. fra det nuværende autonome system ved, at deres output styres af brugerspecificerede input, f.eks. fortyndingshastigheden. Som et første forsøg foretog vi simuleringer af kemostatdyrkede samkulturer ved at tilføje standardstrømstermerne til batchmodellen (supplerende figur 8, supplerende tabeller 4 og 5). Vi fandt i nogle tilfælde, at fortyndingshastigheden definerer en stationær kultursammensætning, som efterfølgende kan “indstilles” inden for et område, der begrænses af fortyndingshastigheden. Denne “tuning” kan opnås ved ekstern modulering af celle-celle-signaleringen, f.eks. ved exogen tilsætning af signalmolekyler. Disse tilfælde illustrerer, hvordan samspillet mellem vores autonome system og andre brugerstyrede systemer kan føre til mere komplekse populationstrajektorier. Vores simuleringsresultater her tjener som en konceptuel ramme for styring af konsortiers sammensætning i mere komplekse, brugerstyrede systemer. Yderligere diskussion af kemostat-simuleringerne findes i supplerende note 3.