Biologi for studerende I

Oplys processen med prokaryote transkription og translation

Prokaryoter, som omfatter bakterier og arkæer, er for det meste encellede organismer, der pr. definition mangler membranbundne kerner og andre organeller. Et bakteriekromosom er en kovalent lukket cirkel, der i modsætning til eukaryote kromosomer ikke er organiseret omkring histonproteiner. Det centrale område af cellen, hvori prokaryote DNA befinder sig, kaldes nukleoidet. Desuden har prokaryoter ofte rigeligt med plasmider, som er kortere cirkulære DNA-molekyler, der måske kun indeholder et eller få gener. Plasmider kan overføres uafhængigt af bakteriekromosomet under celledeling og er ofte bærere af egenskaber som f.eks. antibiotikaresistens. På grund af disse unikke træk er transkription og genregulering noget anderledes mellem prokaryote celler og eukaryote celler.

Prokaryote transkription

Initiering af transkription i prokaryoter

Prokaryoter har ikke membran-omsluttede kerner. Derfor kan processerne transkription, translation og mRNA-nedbrydning alle foregå samtidig. Det intracellulære niveau af et bakterieprotein kan hurtigt blive forstærket af flere transkriptions- og translationsbegivenheder, der finder sted samtidig på den samme DNA-skabelon. Prokaryote transkription dækker ofte mere end ét gen og producerer polycistroniske mRNA’er, der specificerer mere end ét protein.

Vores diskussion her vil eksemplificere transkription ved at beskrive denne proces i Escherichia coli, en velundersøgt bakterieart. Selv om der er visse forskelle mellem transkription i E. coli og transkription i arkæaer, kan en forståelse af E. coli-transkriptionen anvendes på stort set alle bakteriearter.

Prokaryote RNA-polymerase

Prokaryoter bruger den samme RNA-polymerase til at transskribere alle deres gener. I E. coli består polymerasen af fem polypeptidunderenheder, hvoraf to er identiske. Fire af disse underenheder, der betegnes α, α, β og β′, udgør polymerasekerneenzymet. Disse underenheder samles, hver gang et gen transskriberes, og de adskilles, når transkriptionen er afsluttet. Hver underenhed har en unik rolle; de to α-underenheder er nødvendige for at samle polymerasen på DNA’et; β-underenheden binder sig til ribonukleosidtrifosfatet, der bliver en del af det spirende “nyligt fødte” mRNA-molekyle; og β′ binder sig til DNA-skabelonstrengen. Den femte underenhed, σ, er kun involveret i initieringen af transkriptionen. Den giver transkriptionsspecificitet, således at polymerasen begynder at syntetisere mRNA fra et passende initieringssted. Uden σ ville kerneenzymet transskribere fra tilfældige steder og ville producere mRNA-molekyler, der specificerede proteingibberish. Polymerasen, der består af alle fem underenheder, kaldes holoenzym (et holoenzym er en biokemisk aktiv forbindelse, der består af et enzym og dets coenzym).

Prokaryote promotorer

Figur 1. σ-underenheden af prokaryotisk RNA-polymerase genkender konsensus-sekvenser, der findes i promotorregionen opstrøms for transkriptionens startsigte. σ-underenheden dissocieres fra polymerasen, efter at transkriptionen er blevet igangsat.

En promotor er en DNA-sekvens, som transkriptionsmaskineriet binder sig til og igangsætter transkriptionen. I de fleste tilfælde findes promotorer opstrøms for de gener, som de regulerer. Den specifikke sekvens af en promotor er meget vigtig, fordi den bestemmer, om det tilsvarende gen transskriberes hele tiden, en del af tiden eller sjældent. Selv om promotorer varierer mellem prokaryote genomer, er der nogle få elementer, der er bevaret. I -10- og -35-regionen opstrøms for initieringsstedet er der to promotor-konsensussekvenser eller regioner, der ligner hinanden på tværs af alle promotorer og på tværs af forskellige bakteriearter (figur 1).

Den -10-konsensussekvens, kaldet -10-regionen, er TATAAT. -35-sekvensen, TTGACA, genkendes og bindes af σ. Når denne interaktion er foretaget, binder underenhederne af kerneenzymet sig til stedet. Den A-T-rige -10-region letter afviklingen af DNA-skabelonen, og der dannes flere fosfodiesterbindinger. Transkriptionsinitieringsfasen slutter med produktion af abortive transkriptioner, som er polymerer af ca. 10 nukleotider, der laves og frigives.

Transkriptionsforlængelse og terminering i prokaryoter

Transkriptionsforlængelsesfasen begynder med frigivelsen af σ-underenheden fra polymerasen. Dissocieringen af σ gør det muligt for kerneenzymet at fortsætte langs DNA-skabelonen og syntetisere mRNA i 5′ til 3′-retningen med en hastighed på ca. 40 nukleotider pr. sekund. Efterhånden som elongationen skrider frem, afvikles DNA’et kontinuerligt foran kerneenzymet og oprulles igen bagved det (figur 2). Baseparringen mellem DNA og RNA er ikke stabil nok til at opretholde stabiliteten af mRNA-syntesekomponenterne. I stedet fungerer RNA-polymerasen som en stabil linker mellem DNA-skabelonen og de spirende RNA-strenge for at sikre, at elongationen ikke afbrydes for tidligt.

Figur 2. Klik for et større billede. Under elongationen sporer den prokaryote RNA-polymerase langs DNA-skabelonen, syntetiserer mRNA i 5′ til 3′-retningen og af- og tilbagespoler DNA’et, efterhånden som det læses.

Prokaryote termineringssignaler

Når et gen er transskriberet, skal den prokaryote polymerase instrueres til at dissocieres fra DNA-skabelonen og frigøre det nyligt fremstillede mRNA. Afhængigt af det gen, der transskriberes, er der to slags termineringssignaler. Det ene er proteinbaseret og det andet er RNA-baseret. Rho-afhængig terminering styres af rho-proteinet, som følger med bag polymerasen på den voksende mRNA-kæde. Nær slutningen af genet støder polymerasen på en række G-nukleotider på DNA-skabelonen, og den går i stå. Som følge heraf støder rho-proteinet sammen med polymerasen. Interaktionen med rho frigør mRNA’et fra transkriptionsboblen.

Rho-uafhængig terminering styres af specifikke sekvenser i DNA-skabelonstrengen. Når polymerasen nærmer sig slutningen af det gen, der transskriberes, støder den på et område, der er rigt på C-G-nukleotider. MRNA’et foldes tilbage på sig selv, og de komplementære C-G-nukleotider bindes sammen. Resultatet er en stabil hårnål, der får polymerasen til at gå i stå, så snart den begynder at transskribere et område med mange A-T-nukleotider. Den komplementære U-A-region i mRNA-transkriptet danner kun et svagt samspil med skabelon-DNA’et. Dette, kombineret med den fastlåste polymerase, inducerer tilstrækkelig ustabilitet til, at kerneenzymet kan bryde af og frigøre det nye mRNA-transkript.

Med termineringen er transkriptionsprocessen afsluttet. På det tidspunkt, hvor termineringen sker, vil det prokaryote transkript allerede være blevet brugt til at påbegynde syntesen af mange kopier af det kodede protein, fordi disse processer kan finde sted samtidig. Det er muligt at forene transkription, translation og endog mRNA-nedbrydning, fordi alle disse processer foregår i den samme 5′ til 3′-retning, og fordi der ikke er nogen membranopdeling i den prokaryote celle (figur 3). I modsætning hertil udelukker tilstedeværelsen af en kerne i eukaryote celler samtidig transkription og translation.

Figur 3. Flere polymeraser kan transskribere et enkelt bakteriegen, mens talrige ribosomer samtidig oversætter mRNA-transskriptionerne til polypeptider. På denne måde kan et specifikt protein hurtigt nå en høj koncentration i bakteriecellen.

Prokaryote translation

Translationen er ens hos prokaryoter og eukaryoter. Her vil vi undersøge, hvordan translation foregår i E. coli, en repræsentativ prokaryot, og specificere eventuelle forskelle mellem bakteriel og eukaryote translation.

Initiering

Initieringen af proteinsyntesen begynder med dannelsen af et initieringskompleks. I E. coli omfatter dette kompleks det lille 30S ribosom, mRNA-skabelonen, tre initieringsfaktorer, der hjælper ribosomet med at samle sig korrekt, guanosintrifosfat (GTP), der fungerer som energikilde, og et særligt initiator-tRNA, der bærer N-formyl-methionin (fMet-tRNAfMet) (figur 4). Initiator-tRNA’et interagerer med startkodonet AUG i mRNA’et og bærer et formyleret methionin (fMet). På grund af dets deltagelse i initieringen indsættes fMet i begyndelsen (N-terminus) af hver polypeptidkæde, der syntetiseres af E. coli. I E. coli mRNA er der en ledersekvens opstrøms for det første AUG-kodon, kaldet Shine-Dalgarno-sekvensen (også kendt som det ribosomale bindingssted AGGAGAGG), der gennem komplementær baseparring interagerer med de rRNA-molekyler, som udgør ribosomet. Denne interaktion forankrer den 30S ribosomale underenhed på det korrekte sted på mRNA-skabelonen. På dette tidspunkt binder den 50S ribosomale underenhed sig så til initieringskomplekset og danner et intakt ribosom.

I eukaryoter foregår initiationskompleksdannelsen på samme måde, med følgende forskelle:

• Det initierende tRNA er et andet specialiseret tRNA, der bærer methionin, kaldet Met-tRNAi
• I stedet for at binde sig til mRNA’et ved Shine-Dalgarno-sekvensen genkender det eukaryote initieringskompleks 5′-kappen på det eukaryote mRNA og følger derefter mRNA’et i 5′ til 3′-retningen, indtil AUG-startkodonet genkendes. På dette tidspunkt binder 60S-underenheden sig til komplekset af Met-tRNAi, mRNA og 40S-underenheden.

Figur 4. Translation i bakterier begynder med dannelsen af initieringskomplekset, som omfatter den lille ribosomale underenhed, mRNA’et, initiator-tRNA’et, der bærer N-formyl-methionin, og initieringsfaktorer. Derefter binder 50S-underenheden sig og danner et intakt ribosom.

Elongation

I prokaryoter og eukaryoter er de grundlæggende principper for elongation af translation de samme. I E. coli danner bindingen af den 50S ribosomale underenhed til fremstilling af det intakte ribosom tre funktionelt vigtige ribosomale steder: A-stedet (aminoacyl) binder indkommende ladede aminoacyl-tRNA’er. P-stedet (peptidyl) binder ladede tRNA’er, der bærer aminosyrer, som har dannet peptidbindinger med den voksende polypeptidkæde, men som endnu ikke er dissocieret fra deres tilsvarende tRNA. E (exit)-stedet frigør dissocierede tRNA’er, så de kan oplades igen med frie aminosyrer. Der er en bemærkelsesværdig undtagelse fra denne samlebånd af tRNA’er: Under initieringskompleksdannelsen går bakteriel fMet-tRNAfMet eller eukaryote Met-tRNAi direkte ind i P-stedet uden først at gå ind i A-stedet, hvilket giver et frit A-sted, der er klar til at modtage det tRNA, der svarer til det første codon efter AUG.

Elængelsen foregår med enkeltodonbevægelser af ribosomet, der hver især kaldes en translokationsbegivenhed. Under hver translokationsbegivenhed kommer de ladede tRNA’er ind på A-stedet, skifter derefter til P-stedet og til sidst til E-stedet for at blive fjernet. Ribosomale bevægelser, eller trin, fremkaldes af konformationsændringer, der fremskynder ribosomet med tre baser i 3′-retningen. Der dannes peptidbindinger mellem aminogruppen på den aminosyre, der er knyttet til tRNA’et på A-stedet, og carboxylgruppen på den aminosyre, der er knyttet til tRNA’et på P-stedet. Dannelsen af hver peptidbinding katalyseres af peptidyltransferase, et RNA-baseret ribozym, der er integreret i den 50S ribosomale underenhed. Den aminosyre, der er bundet til P-site tRNA’et, er også bundet til den voksende polypeptidkæde. Når ribosomet træder over mRNA’et, går det tidligere P-site tRNA ind i E-stedet, løsner sig fra aminosyren og udstødes. Flere af trinene under elongationen, herunder binding af et ladet aminoacyl tRNA til A-stedet og translokation, kræver energi fra GTP-hydrolyse, som katalyseres af specifikke elongationsfaktorer. Utroligt nok tager E. coli-oversættelsesapparatet kun 0,05 sekunder til at tilføje hver aminosyre, hvilket betyder, at et protein på 200 aminosyrer kan oversættes på kun 10 sekunder.

Terminering

Termineringen af oversættelsen sker, når man støder på et nonsense-kodon (UAA, UAG eller UGA), som der ikke findes noget komplementært tRNA til. Når disse nonsense-kodoner er på linje med A-stedet, genkendes de af frigørelsesfaktorer hos prokaryoter og eukaryoter, hvilket resulterer i, at P-stedets aminosyre løsrives fra sit tRNA og frigør det nyligt fremstillede polypeptid. De små og store ribosomale underenheder dissocieres fra mRNA’et og fra hinanden; de rekrutteres næsten øjeblikkeligt til et andet oversættelsesinit iationskompleks.

Sammenfattende er der flere vigtige træk, der adskiller prokaryote genekspression fra den, der ses i eukaryoter. Disse er illustreret i figur 5 og anført i tabel 1.

Figur 5. (a) Hos prokaryoter foregår transkription og translation samtidig i cytoplasmaet, hvilket giver mulighed for et hurtigt cellulært svar på et miljømæssigt signal. (b) I eukaryoter er transkriptionen lokaliseret til kernen og translationen til cytoplasmaet, hvilket adskiller disse processer og gør det nødvendigt med RNA-processering for at opnå stabilitet.

Tjek din forståelse

Svar på spørgsmålet/spørgsmålene nedenfor for at se, hvor godt du forstår de emner, der blev behandlet i det foregående afsnit. Denne korte quiz tæller ikke med i din karakter i klassen, og du kan tage den igen et ubegrænset antal gange.

Brug denne quiz til at kontrollere din forståelse og beslutte, om du (1) skal studere det foregående afsnit yderligere eller (2) gå videre til næste afsnit.