Cystintransport og cystinosin
Cystin ophobes i lysosomer af cystinotiske leukocytter14 og fibroblaster.44 Kloroquin og andre inhibitorer af lysosomal proteinnedbrydning dæmper reakkumuleringen af cystin i udtømte cystinotiske celler, hvilket indikerer, at intracellulær proteinnedbrydning er kilden til det overskydende cystin45. Cystinindholdet i normale og cystinotiske celler kan også øges ved at belaste dem med cystindimethylester46 eller cystein-glutathion-blandingsdisulfid44; det er dog bemærkelsesværdigt, at udskillelsen af cystin fra lysosomer er markant forringet i cystinbelastede cystinotiske celler44,46 . Cystinudstrømning fra celler, der stammer fra heterozygote bærere af det nefropatiske cystinose-gen, er ikke signifikant nedsat sammenlignet med wild-type celler44 . Måling af cystin-cystin modtransport i lysosomale granula viser imidlertid klart et fravær hos homozygote patienter, med værdier for heterozygote bærere, der er ca. halvdelen af værdierne for normale kontrolceller47; defekt lysosomal cystintransport er således den forårsagende defekt i cystinose.
Den biokemiske diagnose af både patienter48 og heterozygote bærere49 var afgørende for den fine kortlægning af cystinose-genet på kromosom 17p13. Et afgørende gennembrud var påvisningen af genomiske deletioner for en knyttet mikrosatellitmarkør, efterfulgt af identifikation af CTNS-genet inden for det minimale deletionsinterval.50 CTNS-genet består af 12 exoner, der koder for et 367-aminosyreprotein kaldet cystinosin. Cystinosin består af syv transmembrandomæner, en N-terminus på 128 aminosyrer, der indeholder syv glykosyleringssteder, og en cytosolisk C-terminus på 10 aminosyrer. Alle patienter med de forskellige undertyper af cystinose synes at have en mutation i CTNS-genet (dvs. der er indtil videre ingen beviser for genetisk heterogenitet). Den mest almindelige mutation er en 57-kb-deletion, der flytter 5′-regionen opstrøms for exon 1051,52; over 70 % af patienterne med nefropatisk cystinose af nordeuropæisk afstamning er homozygote for denne mutation52 .-54 Bendavid og kolleger har udviklet fluorescens-in-situ-hybridiseringssonder til denne store deletion, den første af sin art for en lysosomal lagersygdom.55 Separate formodede founder-effektmutationer er blevet identificeret i Fransk Canada56 (W138X, af irsk oprindelse) og i Bretagne-provinsen i Frankrig57 (en splejsningsstedsmutation i slutningen af exon 8). En tilbagevendende missense-mutation (G339R) er blevet identificeret i to særlige etniske befolkningsgrupper: to ikke-relaterede familier af amish-mennonitisk afstamning og fem ikke-relaterede familier af jødisk-marokkansk oprindelse.58-61 Yderligere 50 mutationer af CTNS er også blevet identificeret, herunder mindst tre patienter med mutationer i genets promotorregion.62 Patienter med juvenil eller okulær cystinose er homozygote for en “mildere” mutation, typisk en punktmutation uden forstyrrelser i den åbne læseramme; alternativt er disse patienter sammensatte heterozygoter for en mild mutation og en mere alvorlig mutation.17,59
Cystinosin er bredt udtrykt, med særligt rigeligt transkript i bugspytkirtel, muskler og nyre.50 Immunohistokemi med anticystinosin-antistoffer63 og transfektion af celler med epitopmærket komplementært DNA (cDNA)64,65 afslører, at proteinet udtrykkes i lysosomer. Som forventet er ekspressionen af cystinosin særlig robust i den proximale tubulus i nyrerne.63 Lokaliseringen af cystinosin til den lysosomale membran er afhængig af både et tyrosinbaseret GYDQL lysosomalt sorteringsmotiv placeret på den C-terminale hale og på et YFPQA pentapeptid i den femte inter-transmembran loop. YFPQA-motivet er noget unikt, idet det er et sjældent eksempel på et lysosomalt sorteringssignal, der er placeret uden for den cytoplasmatiske hale.64 Det synes at udvise en vis evne til at redde cystinosinsortering i sig selv, idet cystinosin-mutant med et fraværende GYDQL-motiv, men et intakt YFPQA-motiv stadig delvist lokaliseres til lysosomer.65 Et mindretal af cystinosinmutationer påvirker lysosomal målretning af cystinosin på grund af primær forstyrrelse af GYDQL-motivet eller på grund af endnu ikke karakteriserede virkninger på sekundærstrukturen.66
Funktionel karakterisering af cystinosin udnyttede omdirigeringen af proteinet til plasmamembranen i en mutant, cystinosin-.GYDQL, der mangler det C-terminale GYDQL-motiv.67 Cystinosin-.GYDQL fungerer således som en H+-drevet cystintransportør ved plasmamembranen i transficerede celler. Den er meget specifik for L-cystin; andre aminosyrer, især monosulfidcystein, er ikke substrater. Cystinosin er mættet og følger Michaelis-Menton-kinetik med en Km for cystin på ∼280 μM.67 Indadgående transport stimuleres betydeligt af en syre-udadgående ekstracellulær pH-værdi (Fig. 14-6); sammenbrud af denne transmembran-H+ gradient ved tilsætning af nigericin ophæver transporten, hvilket er i overensstemmelse med H+-cystin-kotransport af cystinosin. Lysosomal cystintransport er igen afhængig af tilstedeværelsen af adenosintrifosfat (ATP), som giver brændstof til den lysosomale H+-ATPase og driver cystinudstrømning (Fig. 14-7).46,68,69
Cystinosin-.GYDQL-konstruktionen er blevet udnyttet til funktionel karakterisering af sygdomsassocierede missense-mutationer i cystinosin. For det meste korrelerer transport og kliniske fænotyper med ophævelse af transport ved mutationer forbundet med nefropatisk cystinose og resterende funktion formidlet af konstruktioner, der udtrykker mutationer forbundet med juvenile og okulære subtyper af sygdommen.66 Nogle mutationer, der er forbundet med juvenil cystinose, ophæver imidlertid transporten i forbindelse med cystinosin-.GYDQL, hvilket tyder på, at disse mutationer har mindre effekt på cystinosin i fuld længde udtrykt i lysosomale membraner; en mulighed er, at cystinosin interagerer med lysosomale proteiner, der stabiliserer disse særlige mutantformer.66 Det omvendte forekommer også, således at nogle nefropatiske cystinosemutationer har minimal effekt på transport medieret af cystinosin-.GYDQL.66
Targeted deletion af cystinosin i mus fører til cystinakkumulering i flere organer, herunder nyren.70 Focal aflejring af cystinkrystaller kan påvises i flere væv, herunder inden for proximale tubulusceller. Disse mus udviser imidlertid ikke en proximal tubulopati, hvilket tyder på, at ophobning af cystinkrystaller alene ikke er årsag til sygdommen.70 Okulære anomalier i cystinosin-deficiente mus ligner imidlertid meget patienter med cystinose. Disse dyr udvikler således corneale cystinkrystalaflejringer og depigmenterede pletter i deres nethinde, hvilket indikerer en retinopati.70