Elisabeth giftede sig med Filip II af Spanien, søn af Karl V, den hellige romerske kejser, og Isabella af Portugal i 1559. Oprindeligt blev hun gift ved fuldmagt i Notre Dame (med hertugen af Alba som stedfortræder for Filip), inden hun forlod Frankrig, men den egentlige ceremoni fandt sted i Guadalajara, Spanien, ved hendes ankomst. Ægteskabet var et resultat af freden i Cateau Cambrésis (1559). Hans anden hustru, Maria I af England, var for nylig død, hvilket gjorde Elisabeth af Valois til Filips tredje hustru.
Ved sit bryllup mødte hun maleren Sofonisba Anguissola og Ana de Mendoza, som skulle leve sammen med hende resten af hendes liv. Filip II udnævnte Anguissola til at være hofdame og hofmaler for sin dronning. Under Anguissolas vejledning forbedrede Elisabeth sine færdigheder som amatørmaler. Anguissola havde også indflydelse på hendes børns kunstneriske værker, Isabella Clara Eugenia og Caterina Michaela, i løbet af hendes tid ved hoffet.
Philip var fuldstændig fortryllet af sin 14-årige brud, og i 1564 havde han opgivet sine utroskab. På trods af den betydelige aldersforskel var Elisabeth også ganske tilfreds med sin mand (i breve til sin mor erklærede hun sig selv for heldig at have giftet sig med en så charmerende prins). Filip nød at være vært for ridderturneringer for at underholde sin kone. Elisabeth spillede hofdame for de tre unge prinser ved det spanske hof: Carlos, prins af Asturien, Johannes af Østrig (uægte søn af Karl 5.) og Alexander Farnese, hertug af Parma (søn af Karl 5.’s uægte datter Margareta).
Elisabeth var oprindeligt blevet forlovet med Philips søn, Carlos, prins af Asturien, men politiske komplikationer gjorde det uventet nødvendigt at gifte sig med Philip. Hendes forhold til sin urolige stedsøn Carlos var varmt og venligt. På trods af rapporter om hans tiltagende bizarre opførsel var Carlos altid venlig og blid mod Elisabeth. Da det til sidst blev nødvendigt for Filip at spærre ham inde (hvilket kortvarigt førte til prinsens død), græd Elisabeth i dagevis.
Philip var meget knyttet til Elisabeth og holdt sig tæt ved hendes side, selv da hun var syg af kopper. Elisabeths første graviditet i 1560 resulterede i en dødfødt søn, som i 1564 blev efterfulgt af en abort af tvillingepiger i 1564. Senere fødte hun Infanta Isabella Clara Eugenia af Spanien den 12. august 1566 og derefter Isabellas lillesøster Catherine Michelle af Spanien den 10. oktober 1567. Phillip og Elisabeth var meget tætte på begge deres døtre og købte syltetøj, dukker, legetøj og meget andet til dem. Det siges, at “begge glædede sig over Isabellas fødsel, som om det havde været en søns fødsel”. Elisabeth fik endnu en abort den 3. oktober 1568 og døde samme dag sammen med sin nyfødte lille datter.
Efter Elisabeths død tilbød Catherine de’ Medici sin yngre datter Margaret som brud til Filip. Filip afslog tilbuddet.