Hej,
Jeg postede mit spørgsmål et andet sted, men havde ikke fået svar, jeg vil gerne poste det her og, undskyld det virker dumt spørgsmål, fordi jeg er virkelig forvirret !
Jeg læste et eller andet sted en ting, som forvirrede mig om cDNA. Jeg vil gerne vide, om cDNA er dobbeltstrenget eller enkeltstrenget?
Jeg ved, at cDNA er en kopi af mRNA ved hjælp af omvendt transkriptase, så teoretisk set ville det være enkeltstrenget, ikke sandt, eller tager jeg fejl?
Tak for din feedback
Jeg postede mit spørgsmål andetsteds, men havde ikke fået svar, jeg vil gerne poste det her og, undskyld det virker dumt spørgsmål, fordi jeg er virkelig forvirret !
Jeg læste et eller andet sted en ting, som gjorde mig forvirret om cDNA. Jeg vil gerne vide, om cDNA er dobbeltstrenget eller enkeltstrenget?
Jeg ved, at cDNA er en kopi af mRNA ved hjælp af omvendt transkriptase, så teoretisk set ville det være enkeltstrenget, ikke sandt, eller tager jeg fejl?
Tak for din feedback
For de fleste tilfælde, f.eks. til RT-PCR, 3′ eller 5′ RACE, bruger vi bare enkeltstrenget cDNA (første streng cDNA), mens vi i tilfælde af forberedelse af cDNA til biblioteksopbygning eller RDA/SSH-analyse, som måske har brug for yderligere andet strengsyntesetrin for at generere dobbeltstrenget cDNA.
hi
Du skal skelne mellem 2 ting :
cDNA er generelt det DNA-molekyle, der svarer nogenlunde til mRNA-sekvensen. Det er altså i de fleste tilfælde et dobbeltstrenget molekyle, der indgår i plasmidet til ekspression.
RT PCR : mRNA-molekylet er omvendt transskriberet til cDNA-enkeltstreng. Herefter eliminerer RNase mRNA-molekylet, og man får et enkeltstrenget cDNA-molekyle. Da det næste trin er helt klassisk PCR, er en enkeltstreng ok til eksp (og det første trin, som svarer til sysnthese af den korresponderende andenstreng af et DNA-molekyle, genskaber det rigtige cDNA-molekyle.
Det er korrekt, at cDNA er et dobbeltstrenget molekyle, men for nemheds skyld bruges cDNA også til at designe det omvendt transskriberede molekyle i RTPCR’en. Det bør benævnes som halvt cDNA eller enkeltstrenget cDNA.
cDNA er en forkortelse.
men i de fleste tilfælde defineres cDNA, der er en forkortelse for komplementært DNA, som et enkeltstrenget DNA-molekyle med en nukleotidsekvens, der er komplementær til et RNA-molekyle, og som syntetiseres i laboratoriet fra mRNA ved omvendt transskription…
Så cDNA er enkeltstrenget, indtil der udføres en PCR-reaktion ? Ok, i dette tilfælde, hvordan genererer Taq DNA Polymerase en anden komplementær streng fra kun én ? Når de to primere annealerer til hver side af den samme streng, hvordan kan de så producere den anden streng (den nye komplementære streng)?
I PCR binder en primer til et enkeltstrenget stykke DNA (det er derfor, at det første trin altid er at dentaturere ved 94C (eller deromkring) for at adskille eventuelle dobbeltstrengede molekyler til enkeltstrenge. I tilfælde af første-strengs cDNA fra en RT-reaktion binder kun én primer i første runde… Det betyder at første amplifikationsrunde i en RT-PCR ikke er logrithmisk du syntetiserer blot den anden streng af cDNA. I de efterfølgende runder (runde 2 til runde n) er der logrithmisk amplifikation, fordi både den fremadrettede og den omvendte primer binder sig til den denaturerede dobbeltstrengede template.
I første runde tror jeg, at det er den fremadrettede primer, der binder … Jeg tror det er fordi mRNA=forward streng i genomet og første streng cDNA=komplement til mRNA (eller er det samme som den omvendte streng i genomet)
Nogen tjekker min logik her, jeg forvirrer mig selv… er det rigtigt at mRNA er komplement til den omvendte streng af genomisk DNA??
dvs: mRNA-sekvens=forward strand=5′-3′ sekvens i gDNA (bare med U ikke T)???
HTH
Tak for alt, det er mere klart for mig nu.
Jeg tror det, ja, indtil man støder på et intron, ikke ? 
Vi kan tjekke enhver af dine kendte mRNA-sekvenser i NCBI, genfinde det genomiske hit og sammenligne sekvenserne for at se, om det er rigtigt eller ej.
Yup det er rigtigt, du ville være nødt til at springe intronerne over 
Det lyder som en god måde at teste på, vil prøve senere, hvis jeg får en chance, og lade dig vide … jo mere jeg tænker over det, mRNA-sekvens=forward strand sekvens skal dog være rigtigt …
Tak! 