Fossil struktur af blødt væv
Små vævspletter (0,01-0,4 mm2; Fig. 1a-d og Supplerende Fig. 2-6) er tæt forbundet med fossile fjer (dvs., normalt inden for 500 µm af kulstofholdige fjerrester, Supplerende fig. 2e, g, j, k, o, s, t). Pletterne er definitivt af fossilt væv og afspejler ikke overfladekontaminering med moderne materiale under prøveforberedelsen, da de er bevaret i calciumfosfat (se “Taphonomi” nedenfor); desuden viser flere prøver rande, der delvist overlappes af den omgivende matrix. Vævene har derfor ikke blot klæbet sig til prøveoverfladen som følge af forurening fra luftbårne partikler i laboratoriet.
Fosfatiseret blødt væv i ikke-aviære maniraptoriske dinosaurer og en basal fugl. a-h Backscatter-elektronbilleder af væv i Confuciusornis (IVPP V 13171; a, e, f), Beipiaosaurus (IVPP V STM31-1; b, g), Sinornithosaurus (IVPP V 12811; c, h) og Microraptor (IVPP V 17972A; d). a-d Små uregelmæssigt formede vævspletter. e Detalje af vævsoverflade, der viser polygonal tekstur. f Fokuseret ionstrålefræset vertikalt snit gennem det bløde væv, der viser det indre fibrøse lag, der adskiller to strukturløse lag. g, h Brudt skråt snit gennem det bløde væv, der viser de lag, der er synlige i f
Vævspletter er typisk 3-6 µm tykke og plane (fig. 1a-e). Tværsnit og brudflader viser et indre fibrøst lag (1,0-1,2 µm tykt) mellem to tyndere strukturløse lag (0,2-0,5 µm tykt) (Fig. 1f-h). Den ydre overflade af det strukturløse lag er glat og kan vise en subtil polygonal tekstur defineret af polygoner med en bredde på 10-15 µm (fig. 1e, h).
Det fibrøse lag viser også polygoner (fig. 1f, h og 2a-e samt supplerende fig. 6), der indeholder arrays af tætpakkede fibre med en bredde på 0,1-0,5 µm (fig. 2f-i og supplerende fig. 5f). Velbevarede fibre viser spiralformet vridning (fig. 2h, i). Fibrene i de marginale dele af hver polygon er 0,1-0,3 µm brede og orienteret parallelt med vævsoverfladen; fibrene i det indre af hver polygon er 0,3-0,5 µm brede og er normalt vinkelret på vævsoverfladen (Fig. 2b, h og Supplerende Fig. S6d). I de marginale 1-2 µm af hver polygon er fibrene normalt ortogonale til den laterale polygonrand og slutter ved eller danner bro mellem tilstødende polygoner (Fig. 2f, g og Supplerende Fig. 6e). Polygonerne er normalt ligedimensionelle, men er lokalt langstrakte og gensidigt justerede, hvor de tykke fibre i hver polygon er subparallelle med vævsoverfladen og de tynde fibre parallelle med polygonranden (fig. 2j, k og supplerende fig. 6g-l). Nogle polygoner viser en central fordybning (Fig. 2c-e og Supplerende Fig. 6a-c), hvori de tykke fibre kan omslutte en 1-2 µm bred kugleformet struktur (Fig. 2e).
Ultrastruktur af blødt væv hos Confuciusornis (IVPP V 13171). a, b Backscatter-elektronmikrografer; alle andre billeder er sekundære elektronmikrografer. a, b Tæt pakkede polygoner. c Detalje af polygoner, der viser det fibrøse indhold, med d fortolkende tegning. e-g Polygon (e) med detaljer af de angivne områder, der viser tonofibriller, der danner broer (f) og støder op til hinanden ved (g) krydset mellem polygonerne. h, i Spiralformede vindinger i tonofibriller. h Skråt billede af polygon med centrale tonofibriller orienteret vinkelret på polygonens overflade. j, k Polygoner, der viser strækningslignende deformation
Fossile corneocytter
Tekstureringen af disse fossile væv adskiller sig fra tekstureringen af conchostracaners skaller og fiskeskæl fra værtssedimentet, skallen af moderne Mytilus, moderne og fossil fjerrachis og moderne reptilers epidermis (Supplerende fig. 7a-n). Den langstrakte geometri af nogle polygoner (Fig. 2j, k og Supplerende Fig. 6g, l) antyder elastisk deformation af et ikke-biomineraliseret væv som følge af mekanisk stress. På grundlag af deres størrelse, geometri og indre struktur tolkes de polygonale strukturer som korneocytter (epidermale keratinocytter). Hos moderne amnioter er disse celler polyedriske fladtrykte celler (1-3 µm × ca. 15 µm) fyldt med keratintonofibriller, lipider og matrixproteiner18,19,20 (fig. 3a, b og supplerende figurer 2u-x, 8, 9). Det ydre strukturløse lag af det fossile materiale svarer til cellekanten; det er tykkere end den oprindelige biologiske skabelon, dvs. den hornhindeagtige cellehinde og/eller cellemembranen, men dette er ikke uventet og afspejler diagenetisk overvækst med calciumfosfat (se “Taphonomi”). Fibrene i de fossile corneocytter er identificeret som mineraliserede tonofibriller: lige, uforgrenede bundter af superoprullede α-keratinfibriller med en bredde på 0,25-1 µm18,21 , der er hovedbestanddelen af corneocytcyttens cytoskelet22 og er omsluttet af amorfe cytoskeletale proteiner22. I fossilerne støder de tynde tonofibriller ofte mod de tilstødende cellers (fig. 2g og supplerende fig. 6e), men kan lokalt bygge bro over grænsen mellem tilstødende celler (fig. 2f). Sidstnævnte minder om desmosomer, områder med stærk intercellulær tilknytning mellem moderne corneocytter23. De centrale kugleformede strukturer i de fossile corneocytter ligner døde cellekerner24 , som i corneocytter fra nulevende fugle (men ikke fra nulevende krybdyr og pattedyr)24 (Supplerende fig. 8). Placeringen af disse pycnotiske kerner er ofte indikeret af fordybninger i corneocytoverfladen hos nulevende fugle24 (Fig. 3b); nogle fossile celler viser lignende fordybninger (Fig. 2c og Supplerende Fig. 6a-c).
Corneocytter hos uddøende fugle. a-d Scanningelektronmikrografer af afskudt hud hos uddøende zebrafinke (Taeniopygia guttata (n = 1); a-d). a Korneocytter, der definerer polygonal tekstur. b Central fordybning (pil) markerer placeringen af pycnotisk kerne. c, d Afskyllede hudflager, der er medtaget i fjer
Taphonomi
Keratin er et relativt genstridigt biomolekyle på grund af dets stærkt tværbundne parakrystallinske struktur og hydrofobiske, upolære karakter23. Replikation af de fossile corneocytter i calciumfosfat er derfor noget uventet, da denne proces normalt kræver stejle geokemiske gradienter, der er karakteristiske for tidlig forrådnelse25 og normalt gælder for forrådnelsesfølsomme væv, såsom muskler26 og fordøjelsesvæv27. Modstandsdygtige væv som f.eks. dermal kollagen kan imidlertid replikeres i calciumfosfat, hvor de indeholder en iboende kilde til calcium og især fosfat-ioner, der frigøres under forrådnelsen28. Korneocytter indeholder kilder til begge disse ioner. Under den terminale differentiering stiger de intracellulære koncentrationer af calcium29 , og α-keratinkæderne fosforyleres i vid udstrækning23. Endvidere er korneocytternes lipidgranula30 rige på fosfor og fosfat31. Disse kemiske dele vil blive frigivet under nedbrydningen af granulerne og vil udfælde på det tilbageværende organiske substrat, dvs. tonofibrillerne.
I uddøde pattedyr kræver tætpakkede arrays af tonofibriller rigelige interkeratin-matrixproteiner for at opnå stabilitet32. Disse proteiner er imidlertid ikke tydelige i fossilerne. Dette er ikke uventet, da proteinerne er sjældne i eksisterende aviære corneocytter33 og, hvilket er kritisk, forekommer som spredte monomerer34 og ville have et lavere bevaringspotentiale end tonofibrillenes stærkt tværbundne og polymeriserede keratinbundter. Det ydre strukturløse lag af de fossile corneocytter er tykkere end den eller de sandsynlige biologiske skabelon(er), dvs. den corneøse cellehinde (et lag af lipider, keratin og andre proteiner med en tykkelse på op til 100 nm, der erstatter cellemembranen under den terminale differentiering34 ) og/eller cellemembranen. Dette kan afspejle et lokalt mikromiljø, der fremmer udfældning af calciumphosphat: under den terminale differentiering ophobes granulater af keratohyalin, et kraftigt fosforyleret protein35 med en høj affinitet for calciumioner36, i periferien af de udviklende corneocytter37. Tykkelsen af det ydre faste lag af calciumfosfat i fossilerne samt den gradvise overgang fra dette til det indre fibrøse lag tyder på, at udfældningen af fosfat foregik fra randen til indersiden af corneocytterne. I dette scenario ville fosfattilgængeligheden i cellernes randzoner have været større end den mængde fosfat, der var nødvendig for at replikere tonofibrillerne. Det ekstra fosfat ville have udfældet som calciumfosfat i de interstitielle rum mellem tonofibrillerne og ville have udviklet sig indad fra cellerandens inderside.
Hudafskælning hos fjerdinosaurer og tidlige fugle
I nulevende amnioter er det epidermale kornet lag typisk 5-20 celler tykt (men tykkelsen varierer fra art til art og placering på kroppen38). De fossile korneocytternes pletter er imidlertid én celle tykke (Fig. 1f og Supplerende figurer 5c, 10). Dette, plus den konsekvent lille størrelse (<400 μm) af pletterne og den bemærkelsesværdigt høje bevaringsnøjagtighed, er uforeneligt med selektiv bevaring af et kontinuerligt ark af in situ væv. I et mindretal (n = 8) af eksemplerne forekommer huden i kanten af prøven af fossilt blødt væv og kunne således potentielt repræsentere et mindre fragment af et oprindeligt større stykke fossil hud (med resten af stykket på den fossile plade). I de fleste eksempler er hele omridset af hudfragmentet imidlertid indeholdt inden for kanten af en prøve. Undersøgelse af randen af forskellige prøver ved kraftig forstørrelse afslører, at prøven og det omgivende sediment ofte ligger i nøjagtig samme plan (f.eks. supplerende fig. 10). Selv hvor randen af hudprøven er dækket af sediment, er det usandsynligt, at prøven har været meget større end den tilsyneladende størrelse, da den fossile hud, der er næsten perfekt plan, danner et naturligt fladeplan.
Der er ingen tegn på, at den bevarede tykkelse af huden er et artefakt af præparation eller erosion. Under spaltning af en stenplade passerer spalteplanet ofte gennem de bløde væv på en ujævn måde, hvilket blotlægger strukturer i forskellige dybder. I de fossiler, der er undersøgt her, går spalteplanet normalt gennem corneocytterne (og blotlægger deres indre struktur), og sjældent langs corneocytlagets yderside. Der er ingen beviser for fjernelse af mere end ét lag af corneocytter: FIB-snit viser bevarelse af kun ét lag, og flere SEM-billeder viser komplette vertikale snit gennem den bevarede hud (hvor forholdet til det over- og underliggende sediment er synligt), med beviser for kun et enkelt lag af corneocytter. Den fibrøse indre fyldning af de fossile corneocytter er blottet, hvor den fossile plades delingsplan passerer gennem vævsplakkerne. Topografien af de fossile corneocytter varierer imidlertid med placeringen af splittelsesplanet, som kan variere lokalt gennem det bløde væv på millimeterskala: corneocytterne kan fremstå med hævede kanter og en central fordybning eller med nedtrykte kanter og en central forhøjet zone (Fig. S9).
Størrelsen, den uregelmæssige geometri og tykkelsen af pletterne af corneocytter ligner afskudte flager af det forhornede lag (skællignende partikler39; Fig. 3). Hos uddøde fugle udgydes corneocytter enkeltvis eller i pletter på op til 0,5 mm2 , der kan medtages i fjerene (Fig. 3c, d og Supplerende Fig. 2u, v). De fossiler, der er beskrevet heri, giver det første bevis for hududskillelsesprocessen hos basale fugle og ikke-aviære maniraptoriske dinosaurer og bekræfter, at i det mindste nogle ikke-aviære dinosaurer afgiver deres hud i små pletter40. Denne afskalningsstil er identisk med den, der anvendes hos moderne fugle18 (Fig. 3c, d) og pattedyr20 , og den indebærer en kontinuerlig somatisk vækst. Dette står i kontrast til mange nulevende krybdyr, f.eks, lepidosaurer, som smider deres hud helt eller i store sektioner21, men smidestilen kan påvirkes af faktorer som kost og miljø41.
Evolutionære implikationer af fossile corneocytternes struktur
De fossile corneocytter udviser vigtige tilpasninger, der findes i deres modstykker hos nulevende fugle og pattedyr, især deres fladtrykte polygonale geometri og fibrøse celleindhold, der stemmer overens med α-keratin tonofibriller16. Endvidere viser de fossile tonofibriller (som i ekstante eksempler22) robuste intercellulære forbindelser og danner et kontinuerligt stillads på tværs af korneocytlaget (Fig. 2b, c, j og Supplerende Fig. 6). I modsætning hertil indeholder corneocytter i uddøde krybdyr en homogen masse af β-keratin (med yderligere proteiner til stede i cellekuvertet) og smelter sammen under udviklingen og danner modne β-lag uden tydelige cellegrænser42. Bevarelsen af pycnotiske kerner i de fossile corneocytter er et tydeligt aviært træk, der ikke ses hos moderne krybdyr (men se ref. 20).
Epidermal morfogenese og differentiering anses for at have divergeret hos therapsider og sauropsider31. Vores data understøtter andre beviser for, at fælles epidermale træk hos fugle og pattedyr indikerer konvergent evolution43 og antyder, at lipidrigt corneocytindhold kan være evolutionært afledte karakterer hos fugle og fjerklædte ikke-aviære maniraptoraner. Evo-devo-undersøgelser har antydet, at fugleepidermis kan være opstået som følge af udvidelsen af hængsleregioner i “protofjer”-bærende skællet hud20. Selv om der mangler fossile beviser for denne overgang, viser vores data, at epidermis hos basale fugle og ikke-aviære maniraptoriske dinosaurer allerede havde udviklet en decideret moderne karakter, selv hos taxa, der ikke er i stand til at flyve med motor. Dette udelukker ikke muligheden for, at i det mindste nogle af de epidermiske træk, der er beskrevet her, stammer fra mere basale theropoder, især hvor den bevarede hud mangler tegn på skæl (som hos Sciurumimus44). Forfinede genomiske mekanismer til modulering af den komplekse ekspression af keratin i epidermis45, terminal differentiering af keratinocytter og fordelingen af α- og β-keratinsyntese i huden hos fjerdyr32 blev sandsynligvis modificeret i takt med fjerudviklingen tæt på Maniraptora-basis ved slutningen af den mellemste jurassiske periode (Fig. 4). Eksisterende fossile data tyder på, at dette skete efter udviklingen af næbbet hos Maniraptoriformes og før udviklingen af patagia og pterylae på forbenene (Fig. 4); de første fossile forekomster af alle disse træk strækker sig over ca. 10-15 Ma, hvilket tyder på et innovationsudbrud i udviklingen af fjerintegumentet tæt på og på tværs af grænsen mellem den nedre og den mellemste Jura. De tidligste beviser for dermal muskulatur i forbindelse med fjer er ca. 30 Ma yngre, nemlig hos en fugl fra 125 Ma ornithothoraceen17. I betragtning af den væsentlige rolle, som dette dermale netværk spiller for fjerens støtte og kontrol af fjerens orientering18, kan dets fravær i fjerbevoksede ikke-fyriske maniraptorer afspejle en taphonomisk bias.
Skematisk fylogeni, skaleret til geologisk tid, af udvalgte coelurosaurer, der viser mønsteret for erhvervelse af vigtige modifikationer af huden. Fylogenien er den mest sandsynlige af maximum likelihood-modellerne, baseret på minimum-forgreningslængder (mbl) og overgange, der forekommer som all-rates-different (ARD). Kløer og fodpuder anses for at være primitive hos coelurosaurer. Tilgængelige data tyder på, at modificerede keratinocytter og kontinuerlig afskalning opstod tæt på Maniraptora’s basis; dette forudses at skifte baseret på fremtidige fossile fund mod bunden af Coelurosauria for at inkludere andre befjente taxa
I visse aspekter er de fossile korneocytter tydeligt ikke-aviære og indikerer, at befjente dinosaurer og tidlige fugle havde en unik integumentær anatomi og fysiologi, der var en overgang mellem moderne fugle og ikke-befjente dinosaurer. Hos nulevende fugle er corneocyt-tonofibriller spredt løst blandt intracellulære lipider19; dette letter fordampningskøling som reaktion på varmeproduktion under flyvning og isolering gennem fjerdragt46. I modsætning hertil er de fossile tonofibriller tæt pakket og fylder cellens indre. Der er ingen tegn på post mortem krympning af de fossile corneocytter: størrelsesområdet er i overensstemmelse med dem hos moderne fugle, og der er ingen tegn på diagenetisk rynkning, forvridning eller adskillelse af de enkelte celler. Dette tyder stærkt på, at den bevarede tæthed af tonofilamenter i de fossile corneocytter afspejler oprindeligt højere tætheder end hos nulevende fugle. Dette er ikke en funktion af kropsstørrelsen: uddøende fugle af forskellig størrelse (f.eks. zebrafinke og struds) udviser løst spredte tonofibriller47. De fossile fugle har således sandsynligvis haft et lavere fysiologisk behov for fordampningskøling og dermed en lavere produktion af kropsvarme i forbindelse med flyveaktivitet46 end hos moderne fugle. Dette er i overensstemmelse med andre beviser for lave basale stofskiftehastigheder hos ikke-aviære maniraptoriske dinosaurer47,48 og basale fugle47 og med hypoteser om, at fjerene hos Microraptor49 og muligvis Confuciusornis48 (men se ref. 50) ikke var tilpasset til motorflyvning, i det mindste i længere perioder50.