HBsAg-ekspression i leveren korrelerer med histologiske aktiviteter og viral replikation i kronisk hepatitis B | Annals of Hepatology

Introduktion

Hepatitis B-virus (HBV) infektion er den mest almindelige årsag til levercirrose og hepatocellulært karcinom i de fleste dele af Asien.1,2 Patogenesen af kronisk hepatitis er medieret af interaktionen mellem værtens immunreaktion og hepatocytterne, der præsenterer HBV-antigener.3,4 Tidligere undersøgelser har vist, at ekspressionen af HBV-antigener i hepatocytter har en vigtig sammenhæng med stadiet og aktiviteten af kronisk leversygdom. I immuntolerancefasen findes hepatitis B-kerneantigener (HBcAg) hovedsagelig i kernen og korrelerer med HBV-replikation, mens der i den efterfølgende immunclearingfase sker en intrahepatisk forskydning af HBcAg fra kernen til cytoplasmaet, hvilket er forbundet med den histologiske aktivitet af kronisk hepatitis5,6 . I tilfælde af intrahepatisk ekspression af hepatitis B-overfladeantigen (HBsAg) er der rapporteret om tre mønstre – homogen type, type I ground glass hepatocyte (GGH) og type II GGH. Homogene mønstre i grupperede, diskrete eller svage præsentationer er blevet observeret hos patienter med høj viremi eller aktiv hepatitis. Type I GGH’er er typisk spredt enkeltvis i hepatiske lobuli med inklusionslignende tæt homogen ekspression, mens type II GGH’er udtrykker overfladeantigener i periferien af hepatocytter, som grupperes i grupper, og er generelt til stede i den lave replikationsfase og bliver fremherskende fra aktiv hepatitis til levercirrhose og hepatocellulært karcinom7 .-10 Derfor er både intrahepatiske HBcAg- og HBsAg-ekspressioner tæt forbundet med det naturlige forløb af infektion og HBV-replikation.

Af faserne af kronisk hepatitis B forekommer immunopklaringsfasen eller kaldet HBeAg-positiv kronisk hepatitis B ofte i yngre befolkningsgrupper, udviser mindre alvorlige histologiske aktiviteter og har færre forekomster af precore A1896-mutationer og basal core promoter (BCP) T1762/A1764-mutationer end HBeAg-negativ kronisk hepatitis B.11-14 Forløbet af kronisk hepatitis B er dynamisk som følge af interaktion mellem viral replikation og værtens immunsystem. Derfor observeres der ofte forskellige kliniske træk eller histologiske aktiviteter hos HBeAg-positive patienter. For eksempel udviser 34 til 55 % af patienterne brofibrose eller cirrose i leverhistologi, mens de resterende patienter udviser mild fibrose.15,16 HBsAg-akkumulering i hepatocytter er blevet vist at være forbundet med specifikke virale mutationer og relateret til sygdomsaktivitet.8,9 Det er interessant at undersøge karakteristika for intrahepatisk HBsAg-ekspression hos patienter med forskellig sværhedsgrad af leverhistologi.

Virale mutanter udvikles normalt under pres fra værtens immunovervågning. Blandt naturligt forekommende HBV-mutanter blev BCP T1762/A1764-mutationer udbredt i takt med sygdomsprogressionen og er ofte blevet fundet forbundet med fremskreden leversygdom og hepatocellulært karcinom.17,18 Mønstrene for intrahepatisk HBsAg-ekspression ændrede sig også i løbet af det naturlige forløb af kronisk hepatitis B. Forbindelsen mellem BCP T1762/A1764-mutationer og intrahepatisk HBsAg-ekspression er stadig ukendt og skal undersøges.

Derfor var formålet med denne undersøgelse at evaluere funktionerne af intrahepatisk HBsAg-ekspression og analysere sammenhængen med leverhistologi, virale replikationsmarkører og HBV-mutanter i HBeAg-positiv kronisk hepatitis B.

Materiale og metoderPatienter

I alt 181 behandlingsnaive hepatitis B e antigen (HBeAg)-positive patienter, der opfyldte inklusionskriterierne, blev retrospektivt indskrevet i denne undersøgelse. Inklusionskriterierne var en alder på over 18 år og mindre end 70 år, positiv serum HBsAg i mere end 6 måneder og serum HBV DNA niveau ≥ 100.000 kopier/mL, unormalt serum alaninaminotransferase niveau, ingen anden forklarlig ætiologi af kronisk hepatitis, herunder alkohol, autoimmun hepatitis eller markører for hepatitis C-virus, hepatitis D-virus eller infektion med humant immundefektvirus, og mangel på anti-HBV-behandlingshistorik og leverbiopsiprøver til histologisk vurdering. Serum og leverbiopsi af alle patienterne blev udtaget før antivirale behandlinger, og prøverne blev opbevaret ved -70 oC indtil testning. Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board of National Cheng Kung University Hospital (nr.: ER-99-398). Der blev indhentet informeret samtykke i henhold til Helsinki-erklæringen.

HBV-virologiske analyser

HBV-genotyping blev udført ved multiplex-polymerasekædereaktion, som beskrevet andetsteds.19 HBV-DNA-niveauet i serum blev målt ved hjælp af COBAS Amplicor HBV Monitor-testen (COBAS-AM assay, Roche Diagnostics, Branchburg, NJ). Serum HBsAg-niveauet blev kvantificeret ved Abbott Architect HB-sAg QT (Abbott Diagnostics, Rungis, Frankrig) med et dynamisk område på 0,05-250,0 IU/mL. Prøver med HBsAg-niveauer > 250 IU/mL blev testet igen ved fortyndinger på 1:20 og 1:1000.

Polymerasekædereaktion og sekventering af precore- og BCP-regioner

HBV-DNA blev ekstraheret fra 50 μL serum ved hjælp af Blood and Tissue Genomic Mini Kit (VIOGENE, Taipei, Taiwan). Første runde PCR blev udført under følgende betingelser: 96 oC i 2 min, 94 oC i 1 min, 54 oC i 1 min og 72 oC i 2 min med primere 5′-ACCTCTCTGCACGTAGCATGG (fremad) og 3′-GGATTAAAGACACAGAGGTACAGTACAGTAGAAG (omvendt). Anden runde PCR blev udført under de samme betingelser med primerne 5′-ATGTCTCAACGACACCGACCTTGA (fremad) og 3′-TTCCCACCTTATGAGGAGTCCAAG (omvendt). Rensede PCR-produkter blev derefter direkte sekventeret ved hjælp af en automatiseret DNA-sekventeringsmaskine ABI 310 og ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) med den fremadrettede primer, der blev anvendt under anden runde PCR.

Leverhistologi

Leverhistologi blev vurderet af en enkelt patolog, som ikke kendte patienternes baggrunde. Nekroinflammation og fibrose blev vurderet på grundlag af henholdsvis Knodell-nekroinflammationsgraden (fra 0 til 18)20 og Ishak-fibrosestadiet (fra 0 til 6)21.

Immunohistokemisk farvning blev udført som beskrevet andetsteds.22 Kort fortalt blev deparaffiniserede 5 μm tykke sektioner inkuberet med monoklonalt mus anti-HBsAg (klon 3E7, Dako Corp., Carpinteria,USA) og anti-HBcAg (Novocastra Laboratories, Newcastle, UK) natten over ved 4°C. Den optimale fortynding af anti-HBsAg eller anti-HBcAg blev bestemt ved hjælp af levervæv fra HBV-bærer som positiv kontrol. StrAviGen Super Sensitive MultiLink Kit (BioGenex) blev anvendt til at påvise det resulterende immunkompleks. Peroxidaseaktivitet blev visualiseret ved hjælp af et aminoethylcarbazol-substratkit (Zymed Laboratory, Inc., San Francisco, CA). Endelig blev sektionerne kontrafarvet med hæmatoxylin. Som negativ kontrol blev det primære antistof i inkubationen erstattet af ikke-immunt musemunoglobulin. Mønstre af HBcAg-ekspression i kernen, cytoplasmaet eller begge dele blev registreret. Mønstre af HBsAg-ekspression blev klassificeret som homogene, type I GGH, type II GGH.22 Homogent farvede hepatocytter blev identificeret som hepatocytter med moderat til stærk homogen cytoplasmatisk farvning; type I GGH’er blev identificeret som hepatocytter med tæt globulær eller “inklusionslignende” farvning, og type II GGH’er blev identificeret som hepatocytter med overfladeantigenfarvning ved cellegrænserne eller i periferien.6,22 Type I GGH’er spredes enkeltvis eller grupperer sig i hepatiske lobuli, mens type II GGH’er konsekvent grupperer sig i knuder. Ekspressionsniveauet af HBcAg og HBsAg blev scoret semikvantitativt i henhold til andelen af immunmærkede celler på en skala fra 0 til 4+, svarende til positivitet i 0, 1-10, 11-25, 25-50% og mere end 50% af de undersøgte hepatocytter.

Statistiske analyser

Data blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse. Kontinuerlige variabler blev sammenlignet ved hjælp af Mann-Whitney U-test eller Kruskal-Wallis ANOVA for univariat analyse. Kategoriske variabler blev analyseret ved hjælp af χ2-test eller Fisher’s exact-test. Uafhængige faktorer, der var forbundet med niveauer af intrahepatisk HBsAg-ekspression, blev udført ved hjælp af multivariat logistisk regressionsanalyse. Databehandling og statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS-software til Windows, version 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).

ResultaterKarakteristik af de tilmeldte patienter

Tabel 1 viser de demografiske karakteristika for de 181 tilmeldte patienter. De fleste af patienterne var mænd (69,1 %), og 63,0 % af dem udviste HBV-genotype C. Precore A1896-mutationen blev påvist hos 20 patienter (11,0 %) og BCP T1762/A1764-mutationerne blev påvist hos 38 patienter (21,0 %). Af de 181 patienter blev der påvist positiv HB-sAg-farvning hos 105 patienter (58,0 %). Patienter med HBsAg-farvning udviste signifikant højere serum HBsAg (P

Distributionsmønstre for HBsAg-ekspression

Med hensyn til de 105 patienter, der udviste HBsAg-ekspression, blev der påvist et homogent mønster (figur 1A) hos 34 (32.4%) patienter, type I GGH (Figur 1B) blev påvist hos 50 (47,6%), type II GGH (Figur 1C) blev påvist hos syv (6,7%) patienter, og et blandet mønster blev påvist hos 14 (13,3%) patienter. Som det fremgår af tabel 2, blev der observeret en højere prævalens af BCP T1762/A1764-mutationer i type II GGH (P = 0,001) sammenlignet med andre mønstre. Der var et gensidigt forhold mellem HBsAg-ekspression og virale replikationsmarkører i serum. I figur 1D ses det, at patienter med type II GGH-ekspression havde lavere HBV-DNA-niveauer og HBsAg-titre, men højere intrahepatiske HBsAg-ekspressionsniveauer (figur 1D). Desuden viste leverhistologi viste type II GGH udviste signifikant mere alvorlig levernekroinflammation og fibroseaktiviteter og et højere niveau af intrahepatisk HBsAg-ekspression (figur 1E).