Løsningsstruktur, glykan-specificitet og phenoloxidasehæmmende aktivitet af Anopheles C-type lektiner CTL4 og CTLMA2

Konservering af CTL4/CTLMA2 i Anopheles

CTL4 og CTLMA2 består begge af et signalpeptid, en kort N-terminal sekvens, der indeholder CXCXC-motivet, og et enkelt CTL-domæne. En nylig rapport antydede, at funktionen af CTL4 og CTLMA2 eller deres cofaktorer er divergeret inden for Anopheles, og specifikt at An. albimanus CTL4 ikke indeholder de N-terminale cysteinrester, der er involveret i disulfidbindinger22. Vi undersøgte først ortologerne af CTL4 (AGAP005335) og CTLMA2 (AGAP005334), som har en tæt ryg-til-ryg-orientering på kromosom 2L (Fig. 1a), på ny ved hjælp af de aktuelle genmodeller (pr. februar 2019) i Vectorbase24. Vi fandt proteiner med et N-terminalt CXCXC-motiv for 15/16 CTL4-ortologer, herunder An. albimanus AALB014534, og 13/14 CTLMA2-ortologer. Vi udførte multiple sekvensudligninger af både CTL4 og CTLMA2 fra 10 asiatiske, afrikanske og New World Anopheles-arter (Fig. 1b). De urodfæstede fylogenetiske træer har næsten identisk topologi, og et kombineret fylogenetisk træ har to symmetriske grene, bortset fra An. dirus’ position i forhold til An. funestus og An. maculatus.

Dette understøtter hypotesen om, at CTL4 og CTLMA2 er bevaret inden for Anopheles-slægten, med manglende ortologer, der afspejler ufuldstændig annotation af visse genomer. Vi undersøgte genomregionen hos tre arter med en rapporteret CTL4-ortolog, men ingen CTLMA2-ortolog: An. stephensi ASTE002637, An. minimus AMIN007380 og An. melas AMEC014491. Alle har et tæt eller overlappende gen i omvendt retning – ASTE002636, AMIN007379 og AMEC088499, der omfatter to CTL-domæner. For An. stephensi og An. minimus er det andet CTL-domæne forud af et CXCXC-motiv, hvilket tyder på, at de kan være CTLMA2-ortologer. Hos Aedes- og Culex-myg er situationen mindre klar. En CTLMA2-ortolog, herunder et N-terminalt CXCXC-motiv, er annoteret i Ae. albopictus, AALF001196, og har et tæt ryg-til-ryggende inverteret to-exon-gen AALF001195, der består af en serinprotease og et CTL-domæne. Genmodellen fra oktober 2018 for Ae. aegypti omfatter en CTLMA2-ortolog med N-terminalt CXCXC-motiv, CTLMA14 (AAEL014382), der i øjeblikket er opført som en CTL4-ortolog). En CTLMA2-ortolog er annoteret i C. quinquefasciatus, CPIJ000443, men mangler det N-terminale CXCXC-motiv. Dette tyder på, at CTLMA2 er opstået i en fælles forfader til Anopheles og Aedes, mens CTL4 kan være Anopheles-specifik.

Biokemisk karakterisering

An. gambiae CTL4/CTLMA2 (Ag, Fig. 2a,b), CTL4 og CTLMA2 CRD’er (Fig. S1a) og An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Aa, Fig. S1b) blev udtrykt i insektceller ved hjælp af baculovirus-ekspressionsvektorsystemet (BEVS) og renset til homogenitet. Modent AgCTL4 (25-177) har en molarmasse på 17,3 kDa og pI 7,7. Den modne AgCTLMA2 (18-174) har en molarmasse på 17,9 kDa og pI 4,5. Den oprensede heterodimer har en molekylvægt på 35 kDa på ikke-reducerende (NR) SDS-PAGE (fig. 2a) og elueres som et enkelt peak på size-exclusion chromatography (SEC) med en tilsyneladende molekylvægt på 40 kDa (fig. 2b). Monomer CTL4 og CTLMA2 fremstår på reducerende SDS-PAGE ved henholdsvis 17 kDa og 20 kDa. Som tidligere bemærket kan den øgede tilsyneladende molekylvægt af CTLMA2 afspejle dens usædvanlige (sure) aminosyrefordeling20.

Det er blevet vist, at An. gambiae CTL4/CTLMA2 stabiliseres af et intermolekylært disulfid mellem cysteinerne i det N-terminale CXCXC-motiv; mutation af disse tre cysteiner til alanin ophæver disulfiddannelsen mellem kæderne20. For yderligere at præcisere placeringen af interkædedisulfidet konstruerede vi ni mutanter, der indeholder et enkelt cystein i det N-terminale CXCXC-motiv af CTL4 og CTLMA2, co-eksprimerede proteinerne i Sf9-celler og udførte Western Blotting for at påvise CTL4 og CTLMA2. Intermolekylær disulfiddannelse var ineffektiv, men tydelig på ikke-reducerende SDS-PAGE i alle tilfælde (Fig. 2c).

Det tyder på, at N-terminal intermolekylær disulfiddannelse mellem CTL4 og CTLMA2 er promiskuøs, snarere end at involvere en specifik cysteinrest fra hvert protein. Hvis intermolekylær disulfiddannelse er promiskuøs, kunne CTL4/CTLMA2-heterodimere i princippet danne multivalente disulfid-broderede oligomerer. Der påvises imidlertid ingen disulfidforbundne oligomerer på NR-SDS-PAGE for An. gambiae CTL4/CTLMA2 (fig. 2a). På samme måde kan CTL4 og CTLMA2 danne disulfidbrokkede homodimere in vitro20 , men det oprensede produkt er overvejende (>95%) heterodimere. Der observeres nogle mindre bånd (~10 %) på NR-SDS-PAGE for An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1b), som kan repræsentere homodimer- eller oligomer-dannelse.

Både An. gambiae CTL4/CTLMA2 og An. albimanus CTL4/CTLMA2 er polydisperse i opløsning. Ikke-kovalent oligomerisering af højere orden er tydelig som en skulder af hovedtoppen i SEC med stigende koncentration, og er mere udtalt for An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1). Vi bekræftede eksistensen af oligomeriske arter ved analytisk ultracentrifugering med sedimentationshastighed (AUC) (Fig. 2d). Ved pH 7,5 observeres en række arter af faldende intensitet i c(s)-fordelingen: s1 = 3,1 s, s2 = 4,4 s, s3 = 5,9 s. Oligomerisering er uafhængig af Ca2+ for A. gambiae CTL4/CTLMA2, men stiger væsentligt med Ca2+ for A. gambiae CTL4/CTLMA2. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1b), og er ikke korreleret med pH ifølge dynamisk lysspredning (DLS) (Fig. 2e).

Kalciumbinding

Som CTL’er kan både CTL4 og CTLMA2 binde calcium. De kanoniske Ca2+-bindingsrester i CTL4 er imidlertid muteret, hvilket tyder på, at det kan være en CTLD, men ikke en C-type CRD. Derfor målte vi calciumbindingsaffiniteten af An. gambiae CTL4, CTLMA2 og CTL4/CTLMA2-heterodimeren af An. gambiae og An. albimanus ved hjælp af isotermisk titreringskalorimetri (ITC). Under tilsvarende betingelser blev der observeret binding for CTLMA2 og CTL4/CTLMA2, men ikke for CTL4 (fig. 3a-c). Bindingskonstanter og termodynamiske parametre blev beregnet ud fra resultaterne af tre uafhængige eksperimenter (tabel 1). CTLMA2 Ca2+-binding passer godt til en single site-model med KD = 173 ± 27 μM, ΔH = 12 ± 2 kcal/mol. An. gambiae CTL4/CTLMA2’s affinitet for calcium er ~40 × højere end CTLMA2’s med KD = 4,9 ± 0,5 μM, ΔH = -23 ± 4 kcal/mol. An. albimanus CTL4/CTLMA2 (fig. 3d) har en lignende affinitet for calcium med KD = 2,82 μM, ΔH = -12,1 kcal/mol. Calciumbindingen til både An. gambiae og An. albimanus CTL4/CTLMA2 var imidlertid substoiometrisk (N = 0,36-0,50).

Glykanbinding

CTL4 og CTLMA2 tilhører slægten af myeloide CTL’er – herunder macrophage mannose receptor (MMR) og DC-SIGN – der danner en bevaret familie af immunreceptorer i metazoer15,25. Blandt CTL’er med kendt struktur har CTLMA2 30 % sekvensidentitet med kulhydratgenkendelsesdomænet (CRD) af musens scavengerreceptor (SCRL, PDB ID 2OX9)26 og svine-surfaktantprotein D (SP-D, PDB ID 4DN8)27. CTLMA2 bevarer rester, der er forbundet med Ca2+-binding i den glykanbindende løkke, og det kanoniske EPN-motiv, der er forbundet med D-mannose-selektivitet (fig. 4a). I modsætning hertil mangler CTL4 alle rester, der er forbundet med Ca2+-binding, hvilket er i overensstemmelse med det faktum, at der ikke blev observeret nogen binding ved ITC. Det eneste CTL med kendt struktur med betydelig lighed med CTL4 er faktor IX/X-bindingsprotein (X-bp) fra gift fra den kinesiske moccasin Deinagkistrodon acutus (1IOD). X-bp er et modificeret CTLD, hvor det glykanbindende domæne er erstattet af en lang løkke, der formidler dimerisering for at generere faktor IX/X-bindingsstedet. Selv om nogle insekt-CTL’er derfor ikke kræver calcium til glykanbinding, er det uklart, om CTL4 overhovedet skal binde glykaner.

For at definere deres lektinaktivitet analyserede vi CTL4, CTLMA2 og CTL4/CTLMA2-heterodimeren på glykanarrays, der viser 367 unikke glykanstrukturer28. Disse undersøgelser viste binding til en række glykaner (tabel 2). Monomererne af CTL4 og CTLMA2 viste kun binding til henholdsvis fire og seks glykaner, hvorimod heterodimeren bandt 18 forskellige glykaner. Der er en mærkbar forskel mellem de ligander, der bindes af de enkelte monomerer og heterodimeren; 3/4 (75 %) af de glykaner, der genkendes af CTL4, og 2/6 (33 %) af de glykaner, der genkendes af CTLMA2, blev ikke genkendt af CTL4/CTLMA2.

For at bekræfte glycan array-resultaterne og for at bestemme bindingspræferencerne for CTL’erne blev der udført SPR-analyse (tabel 3). I næsten alle interaktioner var glykanarray og SPR i overensstemmelse med hensyn til tilstedeværelsen af interaktioner, idet SPR indikerede, at glykanarrayet havde fire falsk negative resultater: CTLMA2-monomer med H-antigen, chondroitinsulfat og chondroitin-6-sulfat og CTL4-monomer med chondroitin-6-sulfat. Alle de falsk negative resultater viste imidlertid binding på arrayet med CTL4/CTLMA2-heterodimeren.

CTL’erne genkendte ikke mannoseholdige glykaner, med undtagelse af mannose-6-fosfat af CTL4/CTLMA2, på trods af det kanoniske EPN-motiv, der er til stede i CTLMA2. De genkendte strukturer er snarere generelt glycosaminoglycan (GAG)-motiver, der omfatter β1-3/β1-4-bindinger mellem glucose (Glc), galactose (Gal) og deres respektive hexosaminer GlcNac og GalNac. Galβ1-4Glc-bindingen var til stede i 12/23 (52%) af de genkendte glykaner, herunder 6/23 (26%) indeholdende Galβ1-4GlcNac og 4/23 (17%) indeholdende keratanmotivet Galβ1-4GlcNac β1-3Gal eller GlcNac β1-3Galβ1-4Glc.

Arrayet viste også en vis præference for polymere og sulfaterede glykaner. Af de fire glykaner, der blev genkendt af CTL4, var det stærkeste hit for globopentaose (Gb5, Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc); CTL4 bandt også HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n og β1-3Glucan (Glcβ1-4Glc)n. Tre ud af fem glykaner, der blev genkendt af CTLMA2-monomeren, var sulfaterede, og CTL4/CTLMA2-heterodimeren genkendte chondroitinsulfat og chondroitin-6-sulfat, hyaluroninsyre (GlcAβ1β1-4GlcNAcβ1-3)8 og HA 160 kDa (GlcAβ1β1-3GlcNAcβ1-4)n. Disse resultater tyder på, at der er forskellige og synergistiske virkninger af heterodimerisering på glykanbinding.

Både CTLMA2 og CTL4/CTLMA2-heterodimeren genkender flere fucoseholdige sukkerstoffer, herunder sialyl-LewisX og sulfo-LewisA, men ikke sialyl-LewisA. Den højeste affinitetsbinding blev observeret til sulfo-LewisA med binding til CTLMA2- (106 nM) og CTL4/CTLMA2-komplekset (95 nM) ved en KD på ~100 nM (tabel 3). Den højeste affinitetsbinding, der blev observeret for CTL4, var også til et sulfateret glykan, sulfo-lactosamin (292 nM).

Strukturel analyse

For yderligere at undersøge strukturen af CTL4 og CTLMA2 genererede vi strukturelle modeller af CTL4 og CTLMA2 (Fig. 4b) ved hjælp af MODELLER29 med yderligere manuel redigering. Både CTL4 og CTLMA2 har en udvidet løkke (løkke 1) efter CTLD’s anden helix (Fig. 4a) med en høj tæthed af komplementære ladede rester; basiske rester for CTL4 og sure rester for CTLMA2. Den komplementære elektrostatik af disse loop 1-rester og deres nærhed til det N-terminale CXCXC-motiv tyder på, at dette er en potentiel protein/protein-grænseflade inden for heterodimeren (Fig. 4b), for hvilken der blev genereret en hypotetisk model med en enkelt disulfidbinding i CXCXC-motivet. Glykan/Ca2+-bindingssløjferne er imidlertid en anden potentiel grænseflade, som det blev observeret for de to kæder af D. acutus X-bp. Den alternative hypotese er, at de to CTL-domæner er uafhængige af hinanden, med fleksible linkere, der forbinder dem via den intermolekylære hypotese.

For at teste denne hypotese analyserede vi opløsningsstrukturen af CTL4/CTLMA2 ved hjælp af småvinkelrøntgendispredning (SAXS). Eksperimenterne blev udført i 0,5 M NaCl, 20 mM CHES pH 9,0, 0,5 mM CaCl2 og 1% glycerol for at minimere interpartikelinteraktioner. Under disse betingelser udviste proteinet en lineær sammenhæng mellem ekstrapoleret intensitet ved nulvinkel og koncentration (I0 vs. c) op til en koncentration på 3,1 mg/ml. Den buffer-subtraherede kurve af intensiteten I vs. q (Fig. 4c) blev underkastet SAXSMoW2 , som giver RG = 23,0 Å (I0 = 0,61) og molekylvægt MW = 39 kDa, kun 11 % større end den forventede heterodimer MW på 35 kDa30. Det beregnede Guinier-plot er imidlertid kun baseret på syv datapunkter; tilpasning over et udvidet område (fig. 4c, indsat) giver RG = 24,5 Å (I0 = 0,64), mens tilpasning af den parvise fordelingsfunktion P(r) (fig. 4d) giver et RG = 25,4 Å (I0 = 0,65). P(r)-fordelingen tilpasset af DAMMIF31 med 20 ab initio-perlemodeller med en gennemsnitlig normaliseret strukturel diskrepans NSD = 1,0 ± 0,2. Hoveddelen af ab initio-modellerne har samme form som den forventede CTL4/CTLMA2-heterodimer.

Den ekstra tæthed strækker sig fra hoveddelen af perlemodellerne, som kan afspejle enten den N-terminale sekvens af begge proteiner, herunder CXCXC-motivet, eller en mindre population af CTL4/CTLMA2 med en højere radiusgyration. For at teste denne hypotese udførte vi multi-state-modellering af SAXS-profilen med programmet MULTIFOXS32. Vi genererede en komplet model for CTL4-6xHis/CTLMA2 med en N-terminal coiled-coil termineret af et intermolekylært disulfid mellem CTL4 C39 og CTLMA2 C34. MULTIFOXS genererede et ensemble af 10.000 varianter af modellen til sammenligning med den eksperimentelle spredningskurve. De eneste fleksible rester var CTL4 40-45 og 178-183 (6xHis) og CTLMA2 35-39, med en N-terminal coiled-coil, der tjener som en stiv krop, der forbinder de to kæder. Den bedste one-state-model passede til dataene med χ2 = 1,13 og havde RG = 23,7 Å. Den mindste χ2 = 1,07 blev opnået med en 3-state-model (Fig. 4e), hvor 80 % af spredningen bidrager fra to kompakte modeller med RG = 22,0 Å og RG = 23,7 Å. Disse data er i overensstemmelse med dannelsen af en kompakt heterodimer mellem CTL4 og CTLMA2.

CTL4/CTLMA2 hæmmer phenoloxidaseaktivering som reaktion på E. coli

CTL4 og CTLMA2 fungerer som inhibitorer af myggenes melaniseringsrespons på infektion. Det blev tidligere rapporteret, at CTL4 knockdown ikke førte til øget phenoloxidase (PO)-aktivitet som reaktion på infektion med en blanding af E. coli og S. aureus20. I samme undersøgelse blev det imidlertid konstateret, at dsCTL4- og dsCTLMA2-myg var specifikt modtagelige for Gram-negative bakterier. Derfor undersøgte vi igen virkningen af CTL4- og CTLMA2-nockdown på hæmolymph PO-aktivitet som reaktion på kun E. coli-infektion (Fig. 5a). 4 timer efter infektion med E. coli var PO-aktiviteten signifikant forøget for dsCTL4- (p = 0,02) og dsCTLMA2-myg (p = 0,004) myg sammenlignet med dsLacZ-kontroller (Fig. 5b). Den gennemsnitlige knockdown-effektivitet for CTL4 og CTLMA2 var henholdsvis 93 ± 3 % og 89 ± 3 %, med >80 % i et enkelt forsøg.

Melanisering af Plasmodium ookinetes efter CTL4/CTLMA2-silensering er afhængig af LRIM117,22, TEP133 og SPCLIP133. Da disse alle er elementer af det TEP1 komplementlignende immunrespons, ræsonnerede vi, at øget PO-aktivitet i fravær af CTL4 burde være TEP1-afhængig. I overensstemmelse hermed sammenlignede vi forbedringen af PO-aktiviteten i dsCTL4-myg med samtidig administration af dsTEP1 med samtidig administration af dsLacZ (Fig. 5c). Den gennemsnitlige knockdown-effektivitet for TEP1 var 82 ± 9 % og >80 % i 5/6 eksperimenter (64 % i ét eksperiment). Faktisk var der ingen signifikant forøgelse af PO-aktivitet i dsCTL4-myggen, når TEP1 også blev silenced. Dette bekræfter, at melanisering i fravær af CTL4/CTLMA2 er TEP1-afhængig.

Co-administrering af rekombinant CTL4/CTLMA2 med E. coli vendte signifikant forstærkningen af PO-aktivitet i dsCTL4-myg sammenlignet med BSA (p = 0,007, Fig. 5d). Disse resultater viser, at CTL4/CTLMA2 er direkte involveret som en negativ regulator af PO-aktivitet. I dsLacZ-myggen undertrykte CTL4/CTLMA2 imidlertid ikke E. coli-induceret PO-aktivitet sammenlignet med bovin serumalbumin (BSA). Desuden var den E. coli-inducerede PO-aktivitet i dsCTL4-myg, der var co-injiceret med rekombinant CTL4/CTLMA2 (dsCTL4 + CTL’er), højere end den i dsLacZ-myg, der var co-injiceret med BSA (dsLacZ + BSA). Derfor redder injektion af rekombinant CTL4/CTLMA2 ikke fuldstændigt tabet af endogent protein.