Proteiner

Lysozym var det første enzym, for hvilket røntgenstrukturen blev bestemt med høj opløsning. Dette blev opnået i 1965 af David Phillips, der arbejdede ved Royal Institution i London. Phillips foreslog derefter en mekanisme for lysozymets virkning, som hovedsageligt var baseret på strukturelle data. Phillips’ mekanisme er siden blevet bekræftet af eksperimentelle beviser, som vi skal se senere.

Lysozym findes i vid udstrækning i hvirveldyrs celler og sekreter (herunder tårer og spyt), og æggehvide fra høns er særlig rig på dette enzym. Lysozym katalyserer hydrolysen af de glykosidbindinger, der forbinder N-acetylmuraminsyre (NAM) og N-acetylglucosamin (NAG) i polysacchariderne i bakteriecellens vægge. Derved beskadiger det cellevæggenes integritet og virker derved som et bakteriedræbende middel. NAM-NAG-bindingen er vist i figur 40 med angivelse af stedet for lysozymets spaltning.

Figur 40 Del af polysaccharidkomponenten i bakterielle cellevægge, der viser de vekslende N-acetylmuraminsyre (NAM) og N-acetylglucosamin (NAG)-rester. Dette polysaccharid er et substrat for lysozym, som hydrolyserer den glykosidiske binding ved den angivne position. (Af hensyn til klarheden og for at muliggøre en lineær fremstilling af molekylet er nogle af bindingerne vist i zig-zag-form.)

Lysozym er et relativt lille enzym. Hønseæggehvidelysozym består af et enkelt polypeptid på 129 aminosyrer (figur 41) med en længde på 129 aminosyrer og en Mr på 14 600. Ud fra røntgendiffraktionsdata kan vi se, at der er en tydelig kløft i lysozymstrukturen (figur 42). Det aktive sted er placeret i denne kløft. I aminosyresekvensen i figur 41 og i den rumfyldte model af lysozym i figur 42 er de rester, der omkranser substratbindingslommen i det foldede protein, fremhævet.

Figur 41 Aminosyresekvensen af lysozym fra hønseæggehvide, med de rester, der omkranser substratbindingslommen, fremhævet med grå farve. Asp 52 og Glu 35, som er nøglerester i det aktive sted, er fremhævet med henholdsvis rød og gul.

Figur 42 En rumudfyldende model af hønseæggehvide lysozym, hvor nøgleresterne er fremhævet. Asp 52 er med rødt; Glu 35 er med gult; nogle af de rester, der beklæder substratbindingslommen, er vist med gråt.

Det aktive sted for lysozym er en lang rille, der kan rumme seks sukkerstoffer i polysaccharidkæden ad gangen. Når enzymet binder polysaccharidet, hydrolyserer det en af de glykosidiske bindinger. Hvis de seks sukkerstoffer i polysaccharidstrækningen identificeres som A-F, er spaltningsstedet mellem D og E, som angivet i figur 40. De to polysaccharidfragmenter frigøres derefter. Figur 43 viser faserne i denne reaktion, som også er beskrevet i detaljer nedenfor.

Figur 43 Lysozymets katalytiske mekanisme. Bemærk, at kun centrale rester, der er involveret i katalysen (Glu 35 og Asp 52), er vist. Etaperne er beskrevet i detaljer i teksten. (Baseret på Phillips, 1966)

1. Ved binding til enzymet antager substratet en spændt konformation. Residue D er forvrænget (ikke vist i diagrammet) for at rumme en -CH2OH-gruppe, som ellers ville få en ugunstig kontakt med enzymet. På denne måde tvinger enzymet substratet til at antage en konformation, der nærmer sig overgangstilstandens konformation.

2. Residual 35 i enzymet er glutaminsyre (Glu 35) med en proton, som det let overfører til det polære O-atom i den glykosidiske binding. På denne måde spaltes C-O-bindingen i substratet (figur 43a og b).

3. Residue D i polysaccharidet har nu en positiv nettoladning; dette reaktionsintermediat er kendt som en oxoniumion (figur 43b). Enzymet stabiliserer dette mellemprodukt på to måder. For det første interagerer en nærliggende aspartatrest (Asp 52), som er i den negativt ladede carboxylatform, med den positive ladning af oxoniumionen. For det andet gør forvridningen af rest D det muligt at dele den positive ladning mellem dens C- og O-atom. (Bemærk, at denne deling af ladningen mellem atomerne betegnes som resonans på samme måde som delingen af elektroner mellem atomerne i peptidgruppen). Oxoniumionen er således en overgangstilstand. Normalt ville et sådant mellemprodukt være meget ustabilt og reaktivt. Asp 52 bidrager til at stabilisere oxoniumionen, men reagerer ikke med den. Det skyldes, at de reaktive grupper med en afstand på 3 Å er for langt fra hinanden.

4. Enzymet frigør nu rest E med det tilknyttede polysaccharid, hvorved der dannes et glycosyl-enzym-intermediat. Oxoniumionen reagerer med et vandmolekyle fra opløsningsmiddelmiljøet, hvorved der udvindes en hydroxylgruppe og Glu 35 reprotoneres (figur 43c og d).

5. Enzymet frigiver derefter rest D med sit tilknyttede polysaccharid, og reaktionen er afsluttet.

Den Phillips-mekanisme for lysozymkatalyse, som skitseret ovenfor, understøttes af en række eksperimentelle observationer. Især er betydningen af Glu 35 og Asp 52 i processen blevet bekræftet ved site-directed mutagenesis (SDM) eksperimenter. SDM er en meget effektiv teknik til at undersøge de enkelte aminosyreresteres rolle i et proteins funktion, og den vil blive diskuteret nærmere i afsnit 7.2. SDM indebærer anvendelse af rekombinant DNA-teknologi til selektivt at erstatte den pågældende rest med en anden aminosyre med kritisk anderledes egenskaber. Det resulterende protein kan derefter testes funktionelt, f.eks. med hensyn til substratbinding eller katalytisk aktivitet. Da denne teknik blev anvendt på lysozym for at erstatte Glu 35 med en glutaminrest (Gln), kunne det resulterende protein stadig binde substratet (om end i mindre grad), men det havde ingen katalytisk aktivitet. Glu 35 er derfor afgørende for lysozymets katalytiske aktivitet. Når Asp 52 blev erstattet med en asparaginrest (Asn), havde det muterede protein mindre end 5 % af den katalytiske aktivitet af normalt lysozym (vildtype) på trods af, at den muterede form faktisk havde en dobbelt så høj affinitet for substratet som det normale lysozym. Det følger heraf, at Asp 52 er afgørende for lysozymets katalytiske aktivitet. Eksperimenter med kemiske midler, der kovalent modificerede disse rester uden at påvirke røntgenstrukturen væsentligt, viste ligeledes, at de var essentielle for den katalytiske aktivitet.