1. juni 2016 (Vol. 36, No. 11)
DeeAnn Visk Ph.D. Stifter og hovedskribent DeeAnn Visk Consulting
Genterapi må bryde ind i cellulære volde uden at genopføre Jerichos fald i miniature
Immunoterapier mod kræft, vacciner mod nye vira (eller gamle vira på nye steder) og forsøg på at løse patogene enkeltcellefejl – alle søger at inkorporere transfektionsteknologi. Denne teknologi, som omfatter forskellige metoder til at indføre nukleinsyrer i celler, er meget lovende, men den giver også alvorlige udfordringer.
Disse udfordringer har været mest fremtrædende i forsøgene på at anvende genterapi, som har haft svært ved at løse problemet med svært transficerbare celler, organer og hele dyr.
Disse transfektionsudfordringer er blevet taget op af flere bioteknologiske virksomheder. MaxCyte, Lonza og Mirus Bio tilbyder f.eks. elektroporation som en metode, der kun efterlader få rester. Elektroporation er tilfældigvis ikke egnet til brug på alle dyr, så der er brug for andre metoder. En alternativ teknik er virusinfektion. Den anvendes af virksomheder som GenVec.
En anden udfordring, som er særlig relevant for viral transfektion, er muligheden for at stimulere et immunforsvar. Dette potentielle negative aspekt kan imidlertid være et reelt positivt aspekt i den rette sammenhæng, som tilfældigvis er vaccineudvikling. Thermo Fisher Scientific har specialiseret sig i at udnytte metoder til viral transfektion til at styrke vaccinationsmekanismer. Virksomheden tilbyder også traditionel kemisk baseret transfektion, der virker på hele dyret.
Sammen tilbyder de hidtil nævnte virksomheder teknologier, der dækker alle de vigtigste former for terapeutisk relevant transfektion: kemisk baseret transfektion, ikke-kemiske metoder (hovedsagelig elektroporation) og viral transduktion. Der udvikles også hybride metoder, hvilket vil fremgå af de følgende afsnit.
Elektroporation
MaxCytes elektroporationsplatform er GMP-kompatibel og kan uden problemer skaleres fra forskning til kommerciel skala. “Vores flow-elektroporationssystem gør det muligt at transficere en million til flere hundrede milliarder celler på mindre end 30 minutter i et fuldt automatiseret lukket system,” forklarer Madhusudan V. Peshwa, Ph.D., CSO. “Vores system er både ISO 9000- og FDA-kompatibelt, så det kan nemt imødekomme behovene for fremstilling på terapeutisk niveau.”
“Vi samarbejder rutinemæssigt med farmaceutiske og bioteknologiske virksomheder om at udvikle ex vivo manipulerede immun- og stamcelleterapier. Nogle gange er målet at fremstille vacciner og biologiske lægemidler med højt udbytte, f.eks. antistoffer, hurtigt. Andre gange gør vi det muligt for kunderne at skabe højtiterproduktion af virale vektorer i stor skala ved hjælp af suspensioner og adhærente celler. Dette er ikke kun en hjælp til terapeutisk udvikling, men kan også fremskynde lægemiddelforskningsapplikationer.”
Denne evne til at behandle celler i store eller små antal gør det muligt for forskere i laboratoriet at udvikle en procesprotokol ved hjælp af flowelektroporation til små celleantal. Opskalering af denne proces er derefter problemfri uden den sædvanlige hovedpine med at opretholde kvaliteten, da transfektionsprocessen forbliver den samme.
“Denne reduktion af risikoen er meget attraktiv for vores partnere. At sikre konsistens fra forskning, til klinikken, til kommerciel skala og fra kørsel til kørsel, fra donor til donor og fra patient til patient er afgørende for effektivt at føre terapier gennem udviklingsprocessen,” hævder Dr. Peshwa.
Mens kemiske og lipidtilgange fungerer godt i forskning med etablerede cellelinjer, er der ofte uforudsete konsekvenser ved transfektion af primære celler. Desuden er disse traditionelle kemiske metoder til transfektion af celler vanskelige at opskalere til industriel produktion.
Elektroporation, den nonvirale metode, som MaxCyte anvender, gør det muligt for de transficerede cellers biologi at forblive i en mere naturlig tilstand i enhver skala. Ved at forhindre utilsigtede konsekvenser under transfektionsprocessen kan MaxCytes teknologi undgå at skabe vejspærringer og samtidig løse behovet for høj transfektionseffektivitet.
“Disse terapeutiske indgreb skal være praktisk talt garanteret at have minimal utilsigtet negativ indvirkning på de celler, der modificeres – hele biologien skal være den samme i hvert trin af processen,” insisterer Dr. Peshwa. “Desuden kan vores flowelektroporationssystem bruges på en automatiseret måde. Det anvendes allerede rutinemæssigt i Japan til kommercielle terapeutiske behandlinger og er på forskellige stadier af indførelse i hele verden.”
En anden overvejelse er, hvor transfektionen finder sted. Bliver celler, der er høstet fra en patient, transporteret til en anden by til behandling? Hvad sker der, hvis en pakke går tabt eller forsinkes eller udsættes for temperaturudsving? Den platform, som MaxCyte tilbyder, giver mulighed for at udvikle nye terapeutika ved at behandle patienternes celler på stedet og omgå de store logistik- og COGS-problemer (cost of goods sold), der er forbundet med andre metoder.
Engineering af celler er afgørende for udviklingen af cellebaserede terapeutika. MaxCytes elektroporationssystem kan undgå utilsigtet ændring af cellens fænotype og samtidig opfylde de vigtigste behov for udfordringer i forbindelse med celleteknologi: effektivitet, konsistens, portabilitet og skalerbarhed, ifølge virksomheden.
Virale transduktioner
Virale vektorer er især nyttige til tranfektion af hele dyr eller til brug med væv, der kan være vanskelige at nå via kemiske eller elektroporationsmetoder. GenVec har specialiseret sig i brugen af virale vektorer, især adenovirus, til at levere gener til terapeutiske formål.
“Ved første øjekast synes de problemer, der er forbundet med immunresponset på virale vektorer, at være problematiske”, forklarer Doug Brough, Ph.D., og fortsætter “Vi har imidlertid fundet ud af, at dette kan bruges til at stimulere et immunrespons over for fremmede materialer, således at adenovirusser kan anvendes til at levere vacciner.”
VenVec har nemlig undersøgt adenovirus grundigt og genereret flere forskellige “varianter” af adenovirusser. Når man udforsker adenovirus i andre arter, f.eks. gorillaer og aber, kan forskerne bruge vektorer, der er designet til at undgå den allerede eksisterende immunitet, som den generelle menneskelige befolkning har over for adenovirus.
“Det store bibliotek af vektorer, som GenVec tilbyder, kaldes Adenoverse™,” oplyser Dr. Brough. “Vi har slettet store dele af adenoviruset for at begrænse den medfødte toksicitet, der er forbundet med behandling med adenovirus. Ud over at forhindre et skadeligt immunrespons på vektoren giver dette os mulighed for at passe op til 12 kb i virussen.”
GenVec har ved at udnytte en række forskellige tilgange arbejdet sammen med en række virksomheder om forskellige applikationer, nukleinsyre-terapeutika og genredigeringsteknologier. Modificerede adenovirusser kan levere zinkfingertilgange, både in vitro og in vivo.
Et eksempel på et sådant samarbejde findes med Novartis’ kliniske forsøg med henblik på at regenerere sanseceller i det indre øre. “Ved at inficere celler i det indre øre med et gen, der koder for et vigtigt regulatorisk protein, kan der genereres nye mekanosensoriske celler til erstatning for dem, der er gået tabt på grund af skader eller iboende genetiske forhold”, forklarer Dr. Brough.
Andre fælles projekter findes med partnerskaber i enheder til behandling af kræft og udvikling af vacciner. “Når tiden er inde til at markedsføre en teknologi, bruger GenVec en cellelinje, der tidligere er godkendt af FDA til disse anvendelser,” præciserer Dr. Brough.
“En anden indlysende fordel ved at bruge adenovirus er, at de let kan transficere hele dyr. En ødelæggende sygdom hos husdyr, der kaldes mund- og klovsyge, bliver f.eks. foreviget af en række forskellige virotyper. Vores system kan gøre det muligt hurtigt at udskifte den stamme, der forårsager et udbrud, og gøre det muligt at levere en skræddersyet vaccine hurtigt”, beskriver Dr. Brough.
Nucleofection
Lonza tilbyder en avanceret form for elektroporation kaldet Nucleofection™, som anvender celletypespecifikke transfektionsløsninger kombineret med et mere nuanceret pulse-delivery-system, der giver mulighed for transfektion af mange forskellige celletyper, især normale primære menneskelige celler.
“I stedet for at anvende standard elektroporationsbufferløsninger anvender vi celletypespecifikke transfektionsløsninger”, siger Gregory Alberts, Ph.D., en global ekspert på området hos Lonza. “Dette gør det muligt for os at stabilisere de porer, der genereres under pulstilførsel. Vi spekulerer i, at de porer, der dannes i cellemembranen under standard elektroporation, lukker sig hurtigt. Vores teknologi stabiliserer de porer, der dannes ved elektroporation, og gør det muligt for materialet at diffundere ind i cellen og mere specifikt ind i cellens kerne.”
Nucleofection-tilgangen anvender mange forskellige substrater: DNA, mRNA, siRNA, peptider, proteiner og små molekyler. Transfektionseffektiviteten for siRNA’er og mRNA’er er meget god, bedre end 90 %. Små peptider transficerer normalt med en effektivitet på omkring 80 %, og effektiviteten for plasmid-DNA ligger mellem 50 % og 90 %, afhængigt af celletypen. Selv store substrater, større proteiner som f.eks. antistoffer eller bakterielle kunstige kromosomer (BAC’er), kan komme ind i målcellerne med en rimelig effektiv transfektionseffektivitet.
“Nukleoinfektion er overraskende fleksibel”, erklærer Dr. Alberts. “Det er blevet brugt til at transficere alle slags primære menneskelige celler. Det er blevet brugt til iPSC-generering (inducerede pluripotente stamceller), til transfektion af CRISPR og andre genomredigerende substrater samt til transfektion af mere eksotiske mål såsom Plasmodium-familien af parasitter, der forårsager malaria. Andre lignende organismer kan også transficeres med Nucleofection for at muliggøre forskning i tropiske sygdomme.”
Nucleofection-platformen er skalerbar. For eksempel kan højtydende Nucleofection-systemet med højt gennemløb håndtere 96-well- og 384-well-formater. Ofte vil dette system blive anvendt i en kernescreeningfacilitet. Forskere i laboratoriet kan bruge 4D Nucleofector med lavere gennemløb til at optimere assaybetingelserne. Da 4D Nucleofector på bænken bruger de samme transfektionsbetingelser, arbejder med det samme antal celler og leverer den samme ydelse som de enheder med højere gennemløb, skal assayet ikke optimeres igen, når det er tid til at gå op til en større skala.
“Systemets kontinuitet gør det muligt at sammenligne æbler med æbler, når man skalerer projektet op eller ned,” illustrerer Dr. Alberts.
“Vi er i gang med at beta-teste et nyt transfektionsapparat til store volumener, som vil kunne transficere 200 millioner til 1 milliard celler i et format fra 1 til 20 mL. De foreløbige resultater viser, at enheden transficerer primære humane celler eller cellelinjer på samme niveau som de andre Lonza Nucleofector-enheder”, fortsætter Dr. Alberts. “Dette produkt vil kun blive frigivet til forskningsformål, selv om der på grund af Nucleofection’s evne til at transficere primære humane celler så godt vil der utvivlsomt være interesse for at bruge dette apparat i mere klinisk orienterede applikationer.”
Dr. Alberts forestiller sig, at Nucleofection kan spille en rolle i innovative og personaliserede kræftbehandlinger, såsom CAR-T-behandling (chimær antigen T-celle), samt andre cellebaserede behandlinger, der kræver transfektion eller genomisk ændring af primære menneskelige celler.
“Nucleofection’s evne til let og effektivt at transficere primære menneskelige T-celler vil tiltrække sig opmærksomhed i forbindelse med genterapeutiske tilgange til behandling af sygdomme. Lozas tilgang til potentielle gen-
terapianvendelser har også et meget lille fodaftryk. Dette er afgørende, fordi “restmaskineri” fra andre transfektionsteknikker kan føre til utilsigtede biologiske konsekvenser,” slutter Dr. Alberts.
Videnskabsfolk hos Lonza har evalueret virksomhedens Nucleofection-teknologis evne til at transficere dissocierede voksne aortiske glatte muskelceller (AoSMC’er) fra rotter. Kryokonserverede rotte-AoSMC’er blev optøet og dyrket i syv dage i 24-well kulturplader, og cellerne blev transficeret i adherens ved hjælp af AD1 4D-Nucleofector Y-opløsning. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne fikseret og analyseret. Actin er vist i rødt; GFP i grønt.
Formuleringer
Mirus Bio udvikler og fremstiller nye transfektionsformuleringer, som giver mulighed for høj effektivitet og lav toksicitet ved levering af mange forskellige typer nukleinsyremolekyler. Mange af formuleringerne er fri for komponenter af animalsk oprindelse. “Dyrefri” er en vigtig kvalitet i forbindelse med prækliniske og kliniske anvendelser.
CRISPR-systemet kræver levering af et guide-RNA (gRNA) og ekspression af Cas9-endonukleasen, som kan være i form af protein, mRNA eller DNA. Mirus Bio tilbyder transfektionsløsninger til støtte for effektiv levering af alle de forskellige Cas9-kodningsmolekyler. Ved brug af kemiske transfektionsmetoder til levering af Cas9-protein kan forskere bruge meget lavere niveauer af protein, hvis det er prækomplekseret med gRNA.
“Nogle celletyper, der er vanskelige at transficere, giver højere spaltningseffektivitet ved transfektion af Cas9-protein komplekseret i RNP-komplekset (ribonukleoproteinkomplekset)”, udtaler Laura Juckem, Ph.D., R&D-gruppeleder hos Mirus Bio. “Mirus TransIT-X2® Dynamic Delivery System leverer effektivt RNP-komplekser og gør det muligt at anvende lavere koncentrationer af Cas9-protein sammenlignet med elektroporation.”
En anden udfordring, som virksomhederne står over for, er overgangen fra adherente til suspensionskulturer for at kunne rumme den store mængde materiale, der er nødvendig til kliniske forsøg. Dette gælder især for produktion af rekombinant lentivirus og adeno-associeret virus (AAV). “Vi arbejder tæt sammen med vores kunder for at sikre, at deres transfektioner er vellykkede, og at ændringer i deres arbejdsgang stadig giver et produkt af høj kvalitet”, forklarer Dr. Juckem.
“Til cellebaseret terapi blev CHO-gro® ekspressionssystemet udviklet til at give et højt udbytte af bioterapeutiske proteiner i CHO-celler i suspension. Dette optimerede system fremmer cellevækst med høj tæthed og gør det muligt for forskere at opnå tilstrækkeligt protein til at udføre prækliniske undersøgelser og indledende karakteriseringsanalyser,” slutter Dr. Juckem.
Dette billede fra en Mirus Bio-præsentation, der beskriver den højeffektive transfektion af stamceller, viser, at somatiske celler som f.eks. voksne fibroblastceller kan transficeres eller transduceres via flere metoder med en kombination af transkriptionsfaktorer. Når cellerne er blevet reprogrammeret til en pluripotent tilstand, kan de styres til forskellige skæbner gennem tilsætning af vækstfaktorer og/eller transfektion af selektionsmarkører drevet af celletypespecifikke promotorer. Billedet understreger, at transfektionsreagenser kan tilføjes til en stamcellearbejdsgang på flere punkter.
Hele dyrs fremgangsmåder
Thermo Fisher Scientific holder sig ajour med kundernes behov for at generere mere biologisk relevante data ved hjælp af primære celler i stedet for immortaliserede cellelinjer. Primærceller er traditionelt set vanskeligere at transficere med kemiske metoder. Data genereret fra primære cellekulturer har imidlertid en tendens til at give svar, der bedre kan omsættes til in vivo hel-dyremodeller.
Tredimensionelle cellekulturmodeller, som giver mere relevante resultater end todimensionelle cellekulturer, er vanskeligere at transficere med traditionelle metoder.
“Transfektion af primære kulturer med DNA er en udfordring. Ved direkte brug af siRNA (small inhibitory ribonucleic acid), mRNA (messenger RNA) og protein accepteres det lettere af primærcellerne, da disse forbindelser kun behøver at blive leveret til cytoplasmaet og ikke til cellekernen,” udtaler Xavier de Mollerat du Jeu, ph.d, direktør for R&D hos Thermo Fisher Scientific.
“Leveringen til kernen sker, når cellerne deler sig”, fortsætter de Mollerat “Da primære celler ikke deler sig så let som cellelinjer, kan vi omgå problemet ved at levere molekyler til cytoplasmaet i stedet for til kernen”.”
Idet vi fortsætter vores søgen efter mere biologisk relevante systemer i hele dyr, “har vi fundet ud af, at in vivo brug af Invivofectamine® 3.0 effektivt kan slå ekspressionen af et protein ned med 90 % i leverceller”, forklarer Dr. de Mollerat. “Denne in vivo brug af Invivofectamine giver forskerne en mere effektiv model for, hvordan behandlinger ser ud i hele dyret.”
En anden anvendelse af transfektionsteknologi er udvikling af vacciner. Tidslinjen for udvikling af vacciner kan forkortes enormt ved at anvende transficerede mRNA’er til at udtrykke antigener, som kroppen kan udvikle et immunforsvar imod. I betragtning af antallet af nye vira, der findes i verden, såsom Zika og chikungunya, vil det i høj grad forbedre verdenssundheden at have mulighed for hurtigt at udvikle vacciner.
Med den fortsatte udvikling af immunterapier, der er rettet mod kræft, er T-celler ofte målrettet med specifikke receptorer. “Vi har arbejdet sammen med virksomheder, der er interesseret i at udvikle disse terapier”, forklarer Dr. de Mollerat. “Vi arbejder tæt sammen med virksomhederne for at løse spørgsmålene om, hvordan man fremstiller disse behandlinger, laver disse behandlinger i stor skala og gør dem tilgængelige i hele verden.”
Invivofectamine 3.0 er et reagens, der leveres af Thermo Fisher Scientific til in vivo RNAi-levering. Ifølge virksomheden resulterer en enkelt injektion i en betydelig knockdown på dag 1 og i op til 3 uger. Dette resultat fremgik af en undersøgelse, hvor reagenset blev injiceret i halen på en gnaver i forskellige doser (1, 0,5 og 0,25 mg/kg). Serum blev opsamlet på dag 2, 5, 9, 16, 23 og 30, og serumet blev analyseret for FVII-protein-nedbrydning ved hjælp af en kromogen test. Virksomheden bemærkede, at større mængder siRNA i de injicerede komplekser resulterede i længerevarende knockdown over det testede område.