Transfer RNA

1 Introduktion

tRNA-foldning og -stabilitet er afgørende for effektiv translation, og defekter i begge egenskaber kan føre til reducerede mængder tRNA, hvilket resulterer i vækstdefekter i gær og sygdom hos mennesker (Hopper, 2013; Yarham, Elson, Blakely, McFarland, & Taylor, 2010). I gæren Saccharomyces cerevisiae er der to store cellulære kvalitetskontrolveje, der er kendt for at nedbryde defekte tRNA-arter. Den første vej er den nukleare overvågningsvej, som virker på pre-tRNA i kernen ved hjælp af det nukleare exosom og TRAMP-komplekset (Kadaba, Wang, & Anderson, 2006; Vanacova et al, 2005) ved at nedbryde pre-tRNAiMet, der mangler m1A58-modifikationen eller har en fejlbehandlet 3′-trailer (Ozanick et al., 2009) og en brøkdel af wild-type (WT) pre-tRNA’er (Gudipati et al., 2012). Den anden vej er den hurtige tRNA-nedbrydningsvej (RTD), som nedbryder specifikke modne, hypomodificerede eller destabiliserede tRNA-arter gennem aktiviteten af 5′-3′-ekonukleaserne Rat1 og Xrn1 (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008). RTD fremkaldes i mutanter, der mangler en af flere modifikationer i kroppen af tRNA’et eller gennem destabiliserende mutationer, og for alle identificerede RTD-substrater genopretter MET22-deletion fuldt ud tRNA-niveauer og vækst (Alexandrov et al, 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe, Whipple, Chernyakov, Jaramillo, & Phizicky, 2012; Guy et al., 2014; Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008; Whipple, Lane, Chernyakov, Chernyakov, D’Silva, & Phizicky, 2011). Undertrykkelse af RTD i met22Δ-stammer formodes at skyldes hæmning af exonukleaserne Rat1 og Xrn1 af metabolitten 3′-phosphoadenosin-5′-fosfat, som har forhøjede niveauer, når Met22 er inhiberet (Dichtl, Stevens, & Tollervey, 1997; Murguia, Belles, & Serrano, 1996).

I den anden tilgang blev der anvendt nordblots til at undersøge både hastigheden og specificiteten af tRNA-nedbrydning for RTD-substrater i temperaturfølsomme modifikationsmutanter. I denne fremgangsmåde blev RNA isoleret fra celler på forskellige tidspunkter efter temperaturskiftet analyseret for niveauer af specifikke tRNA’er. Ud fra denne analyse fandt vi, at 50 % af tRNAVal(AAC) blev nedbrudt i en trm8Δ trm4Δ-mutant inden for 30 minutter efter et skift fra 28 til 37 °C, mens de tilsvarende hypomodificerede tRNAiMet, tRNAMet og tRNAPhe ikke viste noget fald (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008). Desuden kunne de relative niveauer af ladet og uladet tRNA måles ved at udføre nordblot under sure forhold, hvilket viste, at niveauerne af ladet tRNAVal(AAC) blev reduceret med 50% inden for 25 min. af temperaturskiftet i en trm8Δ trm4Δ mutant, og at de uladede tRNAVal(AAC) niveauer syntes upåvirket (Alexandrov et al, 2006).

Den tredje tilgang var gennem high-copy tRNA-suppression, hvor et high-copy plasmid, der udtrykker et bestemt tRNA, blev introduceret i en temperaturfølsom tRNA-modifikationsmutant. Hvis tRNA’et var et RTD-substrat, og temperaturfølsomheden var et resultat af, at en enkelt tRNA-art blev nedbrudt, ville overekspression af tRNA’et undertrykke defekten. Således fandt vi, at temperaturfølsomheden hos en trm8Δ trm4Δ-mutant blev undertrykt af et plasmid med høj kopi, der udtrykker tRNAVal(AAC), hvilket indikerer, at temperaturfølsomheden primært skyldtes tabet af tRNAVal(AAC), og at de manglende modifikationer var vigtige for tRNA-stabilitet (Alexandrov et al., 2006). På samme måde er RTD-substraterne i flere andre tRNA-modifikationsmutanter også blevet identificeret ved hjælp af denne fremgangsmåde, herunder tRNASer(CGA) og tRNASer(UGA) i tan1Δ trm44Δ-mutanter (mangler ac4C12 og Um44) og i trm1Δ trm4Δ-mutanter (mangler m2,2G26 og m5C) (Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe et al, 2012; Kotelawala et al., 2008).

For det fjerde brugte vi en genetisk erstatningsmetode til at identificere RTD-determinanter i tRNASer-familien ved at erstatte det enkelte essentielle tRNASer(CGA)-gen (SUP61) med forskellige tRNASer(CGA)-varianter i WT- og met22Δ-stammen og derefter teste for vækst ved forskellige temperaturer. Ved hjælp af denne fremgangsmåde fastslog vi, at de kombinerede acceptor- og T-stamme-stabiliteter var stærke determinanter for RTD-modtagelighed i tRNASer(CGA)-genfamilien (Whipple et al., 2011). Denne konklusion blev yderligere understøttet af en femte tilgang til måling af RTD, hvor vi viste in vitro, at tRNASer(CGA)-varianter, der mangler ac4C12 og Um44, eller med destabiliserende mutationer i acceptorstammen, var mere tilbøjelige til at blive fordøjet af Xrn1 og mere modtagelige for 5′ fosfatfjernelse af kalve-tarmfosfatase (Whipple et al, 2011).

I denne gennemgang vil vi diskutere vores nyligt udviklede sjette og syvende tilgang til undersøgelse af RTD-substrater, som har vist sig at være yderst værdifulde til at udvide vores forståelse af RTD-vejen. Den sjette tilgang anvender en fluorescerende reporter til omfattende analyse af biblioteker med tusindvis af tRNA-varianter i WT- og met22Δ-stammer. Gennem denne tilgang har vi identificeret 643 sandsynlige RTD-substratkandidater, mange i regioner, der ikke forventes at fremkalde RTD på baggrund af tidligere arbejde (Guy et al., 2014). Vi vil vise data, der viser, at denne tilgang kan bruges til at studere tRNA-funktion under forskellige forhold, og vi vil diskutere andre anvendelser af tilgangen.

Den syvende tilgang anvender poisonprimerforlængelse til at måle tRNA-niveauerne i en WT- og met22Δ-stamme og er værdifuld i sin evne til specifikt at måle en variant tRNA selv i tilstedeværelsen af WT tRNA, hvis sekvens måske kun adskiller sig med en enkelt rest. Vi giver en detaljeret metodologi for denne fremgangsmåde og diskuterer nogle af dens andre mulige anvendelser.