Tumor Xenograft

Karakterisering af Xenograft Banks

Arbejde med PDX-tumorer kræver etablering og vedligeholdelse af en bank af tumorer, som implanteres i mus og derefter overføres serielt fra generation til generation, medmindre denne kæde af begivenheder afbrydes ved nedfrysning af prøver. PDX menes at reproducere den oprindelige tumors morfologiske karakteristika mere præcist end xenografts af etablerede cellelinjer med hensyn til histologisk og genetisk profilering. De gengiver heterogeniteten i humane kræftformer og har en bedre værdi til at forudsige respons på behandling.8-16

Inflammatoriske læsioner er generelt lette at identificere ved hjælp af histologiske metoder. For tumorer kan det derimod være vanskeligere at afgøre, om der er tale om den forventede tumor eller om den har en anden oprindelse. Murine tumorer kan nemlig udvikle sig på stedet for xenografts. De fleste af disse tumorer er lymfomer (fig. 4.2B)11 , men der observeres undertiden fusiformcelle-sarkomer (fig. 4.2C), og andre murine tumorer, f.eks. brystkirteltumorer i hunmusenes subkutane væv, kan også i sjældne tilfælde observeres. Spontane tumorer eller tumorlignende læsioner kan også udvikle sig i fjerntliggende organer og kan misfortolkes som mulige metastaser (f.eks. lungeadenomer; Fig. 4.2D). En simpel morfologisk undersøgelse af vævet viser generelt klart, om tumoren er af samme type som den oprindelige humane tumor. Dette gælder især for de fleste carcinom xenografts, som har en morfologi, der adskiller sig meget fra lymfomer eller sarkomer. Karcinomer er generelt dannet af store celler, der er klart arrangeret i snore, tubuli eller lobuli med et fremtrædende bindevævsinterstitium. Lymfomer (både hos mennesker og myrer) består af små runde celler i plader med sparsomt stroma, og sarkomer består af strømme af fusformede celler. Det er derfor let at skelne mellem disse forskellige typer af tumorer med øjnene. Diagnosen kan være vanskeligere, hvis den oprindelige tumor er en “blå tumor”, en tumor bestående af små celler med meget lidt cytoplasma og en hyperkromatisk kerne, der fremstår dybt basofil (blå i farven) under et mikroskop ved lav forstørrelse efter farvning med hæmatoxylin og eosin (H&E). Blastiske tumorer, som f.eks. retinoblastom, er typisk blå tumorer. I sådanne tilfælde kan tumormorfologien være vanskelig at fortolke, især fordi de mest specifikke kendetegn ved nogle tumorer, som f.eks. rosetterne i mange blastiske tumorer, generelt mangler eller er dårligt repræsenteret i xenografts. Anaplastiske tumorer, hvor tumorcellerne kun har ringe eller ingen morfologisk lighed med normale celler, kan også være vanskelige at karakterisere uden hjælpeteknikker. Som nævnt er det relativt let at skelne sarkomer fra lymfomer eller veldifferentierede karcinomer, men det kan være en udfordring at skelne sarkom xenografts fra inflammatoriske læsioner eller murine sarkomer, da disse læsioner kan have en meget ens morfologi6 .

Når der er tale om vanskelige tilfælde, eller blot for at bekræfte, at en tumor virkelig er af menneskelig oprindelse, inden et forsøg påbegyndes, kan flere forskellige metoder, der er designet til at afsløre artsspecifikke proteiner eller nukleotidsekvenser, baseret på immunohistokemi eller in situ-hybridisering, anvendes til at identificere humane eller murine celler. Immunhistokemisk karakterisering af proteiner, der er karakteristiske for en cellelinje, er nyttig til at specificere tumorens oprindelsesvæv.

Der bør lægges særlig vægt på den mulige udvikling af humane lymfomer på indpodningsstedet for ikke-lymfoide tumorer, for det meste under den første implantation.11 Sådanne tumorer bærer de specifikke markører for humane celler; dette kan føre til forveksling med en ægte xenograft, hvis der ikke foretages en morfologisk undersøgelse af læsionen. I PDX-undersøgelser synes de fleste af de observerede humane lymfomer at udvikle sig fra lymfocytter, der er til stede i den vævsprøve, der blev anvendt til den oprindelige indpodning. Hvis disse celler inficeres med Epstein-Barr-virus (EBV), kan B-lymfocytterne undergå en transformation og blive til tumorceller.17,18 Disse celler elimineres effektivt af immunsystemet hos immunkompetente mennesker, mens deres indpodning i immunsvækkede mus gør det muligt for de maligne B-celler at udvikle sig og træde i stedet for den oprindelige humane tumor.11 Nogle få tilfælde af EBV-negative perifere humane T-celle lymfomer er også blevet beskrevet i PDX-sammenhæng.19 Hvis den oprindelige humane tumor var klart forskellig fra lymfom (f.eks. et adenocarcinom), er udviklingen af et humant lymfom let at håndtere, da en simpel morfologisk undersøgelse er tilstrækkelig til at vise, at den tumor, der vokser på engraftningsstedet, ikke er af den forventede type og derfor bør kasseres. Hvis den oprindelige tumor var en “blå tumor”, kan påvisningen af, at den tumor, der findes på podningsstedet, er af menneskelig oprindelse, føre til fejlfortolkning i mangel af yderligere karakterisering, fordi denne tumor i virkeligheden kan være et humant lymfom, der skyldes den maligne transformation af EBV-inficerede lymfocytter, der findes i den oprindelige tumor, som tidligere omtalt.

Når en xenograft er etableret (PDX-tumorer anses generelt for at være stabiliseret efter tre til fem passager20 ), bør den karakteriseres, både med hensyn til dens histologiske type og dens differentiering. Tumorens histologiske type er generelt velbevaret i xenografts, så epidermoide karcinomer og tubuløse adenokarcinomer har f.eks. de samme karakteristika, når de danner PDX.21 Denne fænotypiske stabilitet menes at være forbundet med biokemisk stabilitet, fordi markante biokemiske ændringer sandsynligvis ikke ville resultere i bevarelse af morfologiske karakteristika.6 Det første spørgsmål, som patologen skal tage stilling til, er derfor, om den tilstedeværende tumor reproducerer de morfologiske og biokemiske karakteristika for modervævene.17 Hvis det ikke er tilfældet, kan det svare til en murintumor, eller der kan være sket en større ændring i tumorens differentieringsmønster, hvilket vil kræve yderligere undersøgelser.8

I nogle af første generations transplantater og i stigende grad efter yderligere passager kan nogle tumorer imidlertid have tendens til at blive mindre differentierede, med færre kanaler eller acini i adenokarcinomer og større mitose, nukleær pleomorfi og atypi.20

Specifikke morfologiske detaljer kan ændre sig under serielle passager, f.eks. med erhvervelse af mucinsekretion eller neuroendokrin differentiering, som begge er kriterier for tumorprogression i visse karcinomer (f.eks. prostatakræft).22 På samme måde kan mønstret for tumordifferentiering ændres ved ændringer i engraftningsbetingelserne, f.eks. med ændringer i værtens hormonelle status som følge af kastration eller hormonel supplering.22

Det er en af de vanskeligheder, som patologer står over for, at bestemme, om tumorens morfologi er bevaret efter engraftning, seriel passage eller forsøg. Uafhængige xenografts fra den samme tumor er nemlig aldrig strengt identiske på grund af biologisk variabilitet og intratumorheterogenitet. Selv forskellige sektioner af den samme tumor og forskellige regioner i samme sektion kan udvise morfologiske forskelle. De morfologiske karakteristika ved cellerne og deres kerner, deres rumlige placering, mitoseindekset og tilstedeværelsen af atypiske mitoser, antallet af apoptotiske organer og nekrosefrekvensen, stromaets rigelighed og vaskulaturen varierer fra afsnit til afsnit og fra område til område. Patologen skal derfor afgøre, om tumorens globale mønster er bevaret, og, endnu vigtigere, om den xenograferede tumors histologi svarer til den oprindelige donortumors histologi. Internationale klassifikationer af humane tumorer bør anvendes som grundlag for en nøjagtig patologisk klassifikation af xenografts, men en vis grad af fleksibilitet er nødvendig, da xenografts aldrig perfekt gengiver morfologien af den oprindelige humane tumor.

Når xenografts følges over successive passager eller under eksperimenter, kan kvalitative ændringer, såsom et skift fra et trabekulært til et rørformet mønster, hvis de er reproducerbare, betragtes som signifikante, mens kvantitative ændringer, såsom ændringer i mitoseindekset eller mængden af nekrose, især hvis de er subtile, bør fortolkes med stor forsigtighed.

En anden vanskelighed ved de histologiske analyser af xenobanker af tumorer skyldes den delvist subjektive karakter af den morfologiske analyse. Hvis observatørerne kender morfologien af en bestemt type tumor godt, er deres opfattelse fint indstillet til at opdage små detaljer, som kan blive mere tydelige med tiden. Det er tilrådeligt at udvælge en prøve af stabiliseret PDX til brug som reference til sammenligning med nye prøver for at sikre, at objektglassene læses så objektivt som muligt. En digital bank af virtuelle objektglas kan i høj grad lette denne opgave. Hvis der ikke kan påvises nogen åbenlys forskel mellem prøveglasset og referencen, kan læsionen betragtes som “lignende”; dette betyder ikke, at de er identiske, blot at der ikke kan påvises væsentlige morfologiske ændringer.

For den første prøve, der observeres i et xenograftforsøg, bør referencen være en prøve af den oprindelige humane tumor, eller i det mindste have en morfologisk beskrivelse som den pågældende tumor i patientens patologirapport. Hvis en sådan reference ikke er tilgængelig, kan patologen blot sige, at tumoren er “morfologisk kompatibel” med en xenograft af en menneskelig tumor af en given kategori.