[4] Vergleich von verstärktem grün fluoreszierendem Protein und seiner destabilisierten Form als Transkriptionsreporter

Dieses Kapitel beschreibt den Nutzen des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) als Reportergen bei der Untersuchung der Genexpression. GFP emittiert bei Anregung fluoreszierendes Licht, ohne Zusatz von Substrat oder Cofaktor, sowohl in vivo als auch in vitro. Die GFP-Fluoreszenzaktivität kann mit einem Fluoreszenzmikroskop, einem Fluorometer, einem FACS-Gerät (fluorescence-activated cell sorting) oder einem bildgebenden Mikroplattenlesegerät nachgewiesen werden. Enhanced GFP (EGFP) ist eine GFP-Mutante mit hellerer Fluoreszenz, die den Nachweis wesentlich empfindlicher macht. Die Verwendung von GFP als Reportergen bietet eine Reihe von Vorteilen. Dazu gehören die Echtzeitanalyse, die minimale Probenhandhabung, die Möglichkeit der Analyse großer Mengen und die hohe Empfindlichkeit. Allerdings ist GFP ein stabiles Protein, so dass es sich leicht anreichert, wenn es in Zellen exprimiert wird. Diese Anhäufung macht die induzierbare Expression des Reporters unempfindlich gegenüber Veränderungen in der Induktion, so dass er nur schwer in kinetischen Studien eingesetzt werden kann. In diesem Kapitel wird die Nützlichkeit von EGFP und destabilisiertem EGFP (dEGFP) als Transkriptionsreporter erörtert, indem sie mit der NF-KB-bindenden Sequenz und dem Thymikline-Kinase (TK)-Promotor fusioniert werden, und der Unterschied in der Expression zwischen EGFP und dEGFP verglichen wird. Es wird erörtert, dass sowohl EGFP als auch dEGFP als Reporter in Transkriptionsstudien verwendet werden können. Außerdem reagiert dEGFP aufgrund seiner schnelleren Umsatzrate empfindlicher auf Veränderungen bei der Behandlung mit Tumor-Nekrose-Faktor (TNF).

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