Auswirkungen von Histidin-Protonierung und Rotamerie-Zuständen auf das virtuelle Screening von M. tuberculosis RmlC

Um die Auswirkungen von Histidin-Protonierung und Rotamerie-Zuständen auf die Vorhersagekraft von Rezeptoren zu bewerten, haben wir ein virtuelles Screening (VS) für das Mtb-Enzym RmlC auf der Grundlage der Ergebnisse einer früheren Hochdurchsatz-Screening-Studie (HTS) durchgeführt. Im Folgenden untersuchen wir zunächst die typischen Wechselwirkungen des Co-Kristall-Liganden TRH, um die Abhängigkeit der Ligandenposition von der Histidin-Protonierung zu untersuchen. Des Weiteren kontextualisieren wir die Analyse der Anreicherungsleistung und der Vorhersagekraft verschiedener Rezeptormodelle, indem wir die Wechselwirkungen mit dem Rezeptor erörtern, um die Auswirkungen verschiedener Histidin-Protonierungszustände auf VS aufzuzeigen. Schließlich vergleichen wir die vorhergesagten pKa-Werte, die von mehreren gängigen pKa-Berechnungspaketen berechnet wurden, mit den Rezeptor-Protonierungszuständen mit der besten Vorhersagekraft.

Docking von TRH

Das Andocken des ko-kristallinen Liganden TRH an 36 Rezeptormodelle wurde durchgeführt, um die Abhängigkeit der Pose bzw. der Ligandenorientierung relativ zum Rezeptor von der Histidin-Protonierung und den rotameren Zuständen zu zeigen. Die in Abb. 2b gezeigten chemisch intuitiven Wasserstoffbrückenbindungsmuster für die Kristallkoordinaten von His62 und His119 deuten auf die mögliche Bedeutung von Wasserstoffbrückenbindungen beim Andocken von TRH hin. Das Andocken dieses Liganden ermöglichte eine vorläufige Untersuchung der Abhängigkeit der Pose von den möglichen Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerken mit dem Rezeptor.

Die Variation der Histidin-Protonierungszustände hat eine deutliche Auswirkung auf die Pose-Vorhersage für den ermittelten Co-Kristall-Liganden. Die RMSD der Andockposition von selbst angedocktem TRH an die Kristallkoordinaten für verschiedene Protonierungs- und Rotameriezustände von His62 und His119 variierte von 2,91 bis 5,44 Å. Der Protonierungszustand beider Histidine mit der besten durchschnittlichen RMSD ist HIE, was mit den wahrscheinlichsten Protonierungszuständen der Kristallkoordinaten von TRH übereinstimmt. Außerdem sagt der Docking-Algorithmus in allen Fällen die Position des Pyrophosphats des Liganden korrekt voraus, aber die große Abweichung von den Kristallkoordinaten ist hauptsächlich auf das Umdrehen der Thymidin- und Rhamnose-Einheiten um das Pyrophosphat zurückzuführen, was zu unterschiedlichen Wasserstoffbrückenbindungsmustern zwischen TRH und den beiden Histidinen führt. Dies weist auf die Bedeutung der Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke mit His62 und His119 bei der Posenvorhersage des ko-kristallinen Liganden TRH hin. Nachdem wir die Abhängigkeit der Pose von den Wasserstoffbrückenbindungen zweier Histidine untersucht hatten, erweiterten wir unsere Studie, um die Rangfolge der Verbindungen in VS systematisch zu untersuchen und festzustellen, wie sie von der Protonierung und dem Rotomerzustand der Histidine beeinflusst wird.

Virtuelles Screening

Molekulares Docking wurde durchgeführt, um die Abhängigkeit der Rangfolge der Verbindungen von der Protonierung und dem Rotomerzustand der Histidine zu untersuchen. Der Ligandensatz umfasste zehn aktive und 2.000 inaktive Verbindungen, die nach dem Zufallsprinzip aus einem HTS ausgewählt wurden. Wir stellen fest, dass die Tanimoto-Scores darauf hindeuten, dass die meisten unserer Decoys eine geringe Ähnlichkeit mit den aktiven Substanzen aufweisen. Ein solches Decoy-Set stellt eine geringere Herausforderung für den Docking-Algorithmus dar, und die Vorhersageleistung von VS selbst kann beeinträchtigt werden, wenn Decoys mit größerer Ähnlichkeit zu den Wirkstoffen verwendet werden. In dieser Studie sollte jedoch nicht die Vorhersageleistung des Docking-Algorithmus an sich untersucht werden, sondern wie Histidin-Protonierungszustände die relative Leistung von VS beeinflussen.

Die angedockten aktiven Liganden und das Produktanalogon wurden zunächst untersucht, um wichtige Wechselwirkungen in der RmlC-Bindungsstelle zu charakterisieren. In allen Rezeptormodellen tragen hydrophobe pi-pi-Stapelinteraktionen wesentlich zum Docking-Score der aktiven Verbindungen im RmlC-Aktivzentrum bei. Die erste Hit-Verbindung aus dem HTS, SID7975595, wird in den meisten Rezeptormodellen hoch eingestuft, zwischen Platz 8 und 51 in 26 von 36 Rezeptoren. Obwohl es nur eine begrenzte strukturelle Ähnlichkeit zwischen SID7975595 und dem ko-kristallinen Liganden TRH gibt, ersetzt der trizyklische Ring von SID7975595 problemlos die TRH-Thymidineinheit, während der Benzimidazolonring die Rhamnoseeinheit ersetzt, was die strukturelle Grundlage für die Hemmung darstellt. Wie in Abb. 3 dargestellt, sind an der hydrophoben Wechselwirkung zwischen den Wirkstoffen und dem Rezeptor häufig Tyr132 und Tyr138 der Kette A und Phe26 der Kette B beteiligt (man beachte, dass ein Teil der Kette B in das aktive Zentrum der Kette A eindringt). Durch die Wechselwirkung mit den wesentlichen Resten der Bindungsstelle und die Verhinderung des Zugangs von Wassermolekülen zu Phe26 und Tyr132 bieten die Wirkstoffe reichlich hydrophobe Kontakte, um eine hohe Bindungsaffinität zu erreichen. Wie in Sivendran et al. erörtert, wird durch die Substitution der Ethylgruppe, die an den Stickstoff des trizyklischen Rings von SID7975595 gebunden ist, durch eine Allylgruppe (z. B. der Wirkstoff 77074) die Bindungsaffinität durch Bildung einer noch engeren hydrophoben Abdichtung weiter erhöht. Im Vergleich dazu führt die Substitution dieser Gruppe durch eine kleinere Methylgruppe oder ein Wasserstoffatom zu einer geringeren Bindungsaffinität. Zusätzlich zu den oben beschriebenen hydrophoben Kontakten bilden einige der Wirkstoffe auch Wasserstoffbrückenbindungen mit Ser51, Arg59 und Arg170. Eine Abbildung, die die Wechselwirkungen der angedockten Wirkstoffe beschreibt, ist in der Online-Ressource 3 zu finden.

Interessanterweise erreichen die Wirkstoffe im Allgemeinen keine polaren Wechselwirkungen mit His62 und His119. Wie in Abb. 3 gezeigt, sind der Carbonylsauerstoff und die beiden Benzimidazolon-Stickstoffe von SID7975595 von His62 und His119 abgewandt. Die Richtung der aromatischen Wasserstoffatome der Wirkstoffe ist oft nicht in der Lage, sich an Wasserstoffbrückenbindungen mit den beiden Histidinen zu beteiligen. Dennoch beeinflussen unterschiedliche Protonierungs- und Rotameriezustände dieser Histidine die VS-Ergebnisse durch ihre Wechselwirkungen mit den Decoys.

Bewertung von Unterschieden in der Rangfolge

Es ist nicht ungewöhnlich, dass nur die obersten 1 % der untersuchten Verbindungen in einer VS-Studie experimentell getestet werden können, da die Ressourcen begrenzt sind. Daher ist der Anreicherungsfaktor (EF1%), der die Anreicherungsleistung der Datenbank in den obersten 1 % (20 angedockte Verbindungen) einer Bibliothek widerspiegelt, für die Bewertung der Vorhersagekraft von VS besonders wichtig. Der EF1% reicht von 0 bis 80 für 36 Rezeptormodelle (Tabelle 1), was darauf hindeutet, dass die VS-Ergebnisse empfindlich auf die Protonierungs- und Rotameriezustände von His62 und His119 von RmlC reagieren. Nichtsdestotrotz rangieren 28 von 36 Rezeptoren mit mehr als acht Wirkstoffen in den oberen 10 % der VS, wie aus der EF10% (Tabelle 1) hervorgeht, was darauf hindeutet, dass die meisten Rezeptoren in der Lage sind, die Wirkstoffe und Köder zu unterscheiden, wenn ein größerer Teil (10 %) der Datenbank berücksichtigt wird. Die EF-Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die Rezeptormodelle mit HIP62 oder HIP119 tendenziell eine schlechte Anreicherungsleistung aufweisen, was wahrscheinlich auf die umfangreichen Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke mit den Decoys zurückzuführen ist, wie später erläutert wird.

Die Fläche unter der Receiver-Operating-Characteristic-Curve (AUC) für jedes Rezeptormodell wurde ausgewertet, um die Anreicherungsleistung der Modelle bei unterschiedlichen Protonierungs- und Rotameriezuständen von His62 und His119 zu ermitteln. Wie aus Abb. 4a und Tabelle 1 hervorgeht, liegen die AUC-Werte aller Rezeptormodelle zwischen 0,868 und 0,996, was auf eine insgesamt gute Vorhersageleistung hindeutet (eine AUC von 0,5 entspricht keiner Unterscheidung zwischen Wirkstoffen und Lockstoffen). Im Allgemeinen ergänzt das AUC-Ergebnis die EF-Bewertung der Vorhersageleistung der Rezeptoren. Abb. 4c fasst Tabelle 1 zusammen und zeigt, wie der Bereich der Rezeptorleistung von den beiden Histidin-Protonierungs- und Rotameriezuständen abhängt. Betrachtet man den 25-75 %-Bereich der AUCs (Abb. 4c, gekennzeichnet durch die dickeren Linien), so zeigen die His62-Modelle eine größere Variation zwischen den His119-Zuständen. Die His119-Modelle hingegen weisen unabhängig von den Protonierungszuständen von His62 eine konsistentere Leistung auf, mit Ausnahme des HIP-Zustands. Dies deutet darauf hin, dass unterschiedliche Protonierungszustände von His62 einen geringeren Einfluss auf die Rezeptorleistung in unserem Screening haben als die von His119.

Eine stärkere Abhängigkeit der Anreicherung von den Protonierungszuständen von His119 wird bei den Modellen HIE62 und HIP62 beobachtet. Beim HIE62-Zustand liefern die Modelle mit umgedrehtem HIP119 (Modell 6) und umgedrehtem HIE119 (Modell 2) die höchste Rezeptorleistung. Die Modelle 3 und 5 mit HID119 bzw. HIP119 führen zu der schlechtesten Anreicherung. Bei der Untersuchung, warum der HIE62-Zustand die größte Variation in den AUCs aufweist, stellt man fest, dass His62 entweder pi-pi-Stacking oder keine Wechselwirkungen mit Liganden hat und nur wenige Wasserstoffbrückenbindungen mit hochrangigen Decoys eingeht. Daher hängt die Leistung des Rezeptors von der Wechselwirkung von His119 mit den Decoys ab. Dies wird auch deutlich, wenn man den breiten Leistungsbereich der AUCs der HIP62-Modelle untersucht. Die Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke mit den Decoys werden im folgenden Abschnitt erörtert.

Um die statistische Signifikanz des Unterschieds der AUC-Werte zwischen einem Paar von Rezeptormodellen zu bewerten, führten wir einen zweiseitigen p-Test auf dem 95 %-Niveau für die Nullhypothese durch, dass das Paar statistisch vergleichbare AUC-Werte hat, gegenüber der Alternativhypothese, dass ihr Unterschied bei den AUC-Werten und der Vorhersagekraft statistisch bedeutsam ist. Das Ergebnis ist in der Online-Ressource Tabelle 1 dargestellt, wobei die p-Werte unter 0,05 hervorgehoben werden. Im Durchschnitt weisen die Rezeptoren mehr als 16 p-Werte unter 0,05 auf, was die Empfindlichkeit von VS auf Histidin-Protonierung und rotamere Zustände zeigt. Wie zu erwarten, entsprechen die Rezeptoren mit den signifikantesten Unterschieden den Modellen mit den höchsten (Modell 6) oder niedrigsten AUC-Werten (Modelle 3, 29 und 5). Modell 6 ist statistisch gesehen besser in der Lage, die Wirkstoffe den Lockstoffen vorzuziehen als die 26 anderen Rezeptoren im Ensemble. Die Modelle 3, 29 und 5 sind bei der Einstufung der Wirkstoffe deutlich schlechter als 29, 25 bzw. 31 andere Rezeptoren.

Eine quantitative Analyse der Wasserstoffbrückenbindungsinteraktionen wurde für die obersten 1 % (20 angedockte Verbindungen) jedes VS-Ergebnisses durchgeführt, um die zahlreichen Wasserstoffbrückenbindungsinteraktionen mit den Resten der Bindungsstelle zu berücksichtigen, die häufig bei den Decoys beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen eine umgekehrte Korrelation zwischen dem Beitrag der Wasserstoffbrückenbindungen und der Leistung des Rezeptors. Abbildung 4b zeigt den durchschnittlichen Wasserstoffbrückenbindungsanteil jedes Rezeptormodells für die besten 1 % der angedockten Verbindungen. Der Wasserstoffbrückenbindungsanteil ist definiert als der Anteil des Glide XP Wasserstoffbrückenbindungs-Terms an der gesamten Docking-Punktzahl. Der Vergleich von Abb. 4a, b zeigt die inverse Beziehung zwischen dem Wasserstoffbrückenbindungsanteil und der AUC mit einem R2 von 0,42 (y = -56,18x + 67,95, die Korrelation ist in Online Ressource 4 dargestellt). Die inverse Beziehung wird häufig bei Modellen mit HIP119, geflipptem HIP119 oder HID62 beobachtet, bei denen der hohe Wasserstoffbrückenbindungsanteil zu einer schlechten Anreicherung führte. Das Rezeptormodell 29 mit HIP62 und HIP119, bei dem beide Histidine dem aktiven Zentrum zugewandte Wasserstoffbrückenbindungsdonatoren darstellen, hat beispielsweise eine der schlechtesten AUCs aufgrund des hohen Anteils an Wasserstoffbrückenbindungen in den Top-Treffern.

Das Wasserstoffbrückenbindungspotenzial von His119 bestimmt häufig die Rezeptorleistung. Zum Beispiel war das Modell mit HID62 und HIP119 ein Ausreißer unter den HID62-Modellen in Abb. 4c, mit auffallend geringer Anreicherung im Vergleich zu der insgesamt guten Leistung der anderen fünf HID62-Modelle. Die HID62-Modelle haben eine hohe mittlere AUC von 0,989, trotz der häufigen Wasserstoffbrückenbindungen zu den Decoys von HID62. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die His119-Zustände nur wenige Wasserstoffbrückenbindungsinteraktionen mit den Decoys eingehen. Nur beim HIP119-Zustand geht das HID62-Modell Wasserstoffbrückenbindungen mit einer Reihe von Decoys ein, was zu der relativ niedrigen AUC führt. Diese Beobachtung stimmt mit der stärkeren Abhängigkeit der Rezeptorleistung von den Protonierungszuständen von His119 überein, wie oben beschrieben. Online-Ressource 4 beschreibt die AUC-Verteilung und den prozentualen Anteil der Wasserstoffbrückenbindungen zusammen mit der Richtung der Wasserstoffbrückenbindungs-Donatoren oder -Akzeptoren von zwei Histidinen, die dem Rezeptor zugewandt sind.

Die obigen Analysen verdeutlichen die behindernde Wirkung der Wasserstoffbrückenbindungen zu den Decoys auf die Vorhersagekraft von VS aufgrund der verschiedenen Koordinaten von zwei Histidinen mit unterschiedlichen Protonierungs- und Rotameriezuständen. Die Streuung der beobachteten Korrelation mit einem R2 von 0,42 ist wahrscheinlich auf mehrere Ursachen zurückzuführen, darunter die chemische Natur des Decoy-Datensatzes sowie die leichten Unterschiede in der Geometrie jedes Rezeptors bei der Minimierung in der anfänglichen Vorbereitung des Proteins. Indem wir die Empfindlichkeit der Ergebnisse des virtuellen Screenings auf unterschiedliche Protonierungs- und Rotameriezustände der Histidine im aktiven Zentrum deutlich zeigen, betonen wir, dass bei der Vorbereitung der Atomkoordinaten eines Rezeptors für VS Vorsicht geboten ist, insbesondere unter Berücksichtigung der allgemeinen Eigenschaften der zu screenenden Liganden. Dazu gehört die Berücksichtigung der Wasserstoffbrückenbindungen zum ko-kristallinen Liganden und deren Auswirkung auf die Proteinpräparation sowie eine umfassende Analyse der proximalen Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke. Dies wird in der Regel durch die Untersuchung der Ergebnisse von weit verbreiteten pKa-Vorhersage-Softwarepaketen erreicht, und bis zu diesem Punkt haben wir die Ergebnisse von verschiedenen Paketen mit unseren VS-Ergebnissen verglichen und diskutieren sie weiter.

Docking der Decoys

Viele Faktoren führen zu Unterschieden in der Rangfolge der Rezeptoren, insbesondere im Hinblick auf die Decoys. Im Allgemeinen waren die Decoys, die höher als die aktiven Substanzen eingestuft wurden, von hohem Molekulargewicht und hatten ein größeres Potenzial, Wasserstoffbrücken mit dem Rezeptor zu bilden. In diesem Abschnitt werden die häufigen Interaktionsmuster zwischen den Decoys und dem Rezeptor weiter analysiert, wobei der Schwerpunkt auf den Rezeptormodellen mit geringer Anreicherung liegt.

Decoys haben tendenziell ein höheres Molekulargewicht und mehr Ringstrukturen als die Wirkstoffe (Tabelle 2). Dies führt dazu, dass die Decoys aufgrund von hydrophoben Wechselwirkungen in Abwesenheit von Wasserstoffbrückenbindungen zum Rezeptor eine höhere Rangfolge aufweisen. Abbildung 5a zeigt die hydrophoben Wechselwirkungen, die durch die große inaktive Verbindung 16952387 im Rezeptormodell 19 erzielt werden. Diese Verbindung rangiert in vielen VS-Läufen unter den ersten fünf, da sie erhebliche pi-pi-Stapelwechselwirkungen mit Phe26, Tyr132 und Tyr138 aufweist. Dieser Trend ist häufig beim virtuellen Screening zu beobachten, bei dem größere Moleküle aufgrund umfangreicher Wechselwirkungen mit dem Rezeptor besser abschneiden.

Die Anreicherungsleistung ist besonders gering für die Rezeptoren, die reichlich Wasserstoffbrückenbindungen zu den Täuschungsmitteln bereitstellen. Wechselwirkungen über His62 und His119 wurden bei den Wirkstoffen nicht häufig beobachtet, so dass Verbindungen mit größeren enthalpischen Beiträgen fälschlicherweise besser abschneiden. Ein Beispiel in Abb. 5b zeigt die Interaktion der inaktiven Verbindung 17388064 im Rezeptormodell 3 (AUC 0,868), das an erster Stelle steht. In diesem Rezeptor, der bei der Einstufung von Verbindungen auf der Grundlage der AUC am schlechtesten abschneidet, bildet die Verbindung 17388064 zwei Wasserstoffbrückenbindungen mit zwei Histidinen, eine zwischen ihrem Hydroxylwasserstoff und dem δ-Stickstoff von HIE62 und die andere zwischen ihrem Hydroxylsauerstoff und dem Wasserstoff am δ-Stickstoff von HID119. Diese Verbindung hat fünf Wasserstoffbrückenbindungs-Donatoren und neun Akzeptoren, eine große Zahl im Vergleich zu den jeweiligen Durchschnittswerten der Decoys und Aktiva (Tabelle 2). Mit einem hohen Anteil an Wasserstoffbrückenbindungen an der Gesamtpunktzahl von 34,7 ± 6,62 % wird diese Decoy-Verbindung daher häufig beobachtet, um mindestens eine Wasserstoffbrückenbindung mit einem der beiden Histidine zu bilden, wodurch sie in mehreren VS-Durchläufen hohe Ränge erreicht.

Zwei weitere Rezeptormodelle, Modell 29 mit HIP62 und HIP119 und Modell 5 mit HIE62 und HIP119, zeigen ähnliche Interaktionsmuster mit Decoys wie Modell 3. Diese drei Modelle haben die niedrigsten AUC-Werte, mit einem Durchschnitt von 0,870. Wie bereits erwähnt, unterscheiden sich ihre AUC-Werte erheblich von denen der anderen Rezeptoren, was die subtile Beziehung zwischen den durch His62 und His119 erzielten Wasserstoffbrückenbindungen und der geringen Anreicherung widerspiegelt. Eine zusätzliche Abbildung, die die Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke zwischen den Decoys und den Rezeptoren beschreibt, ist in der Online-Ressource 5 zu finden.

pKa-Vorhersage für His62 und His119

Unsere Ergebnisse zeigen deutlich, wie empfindlich das virtuelle Screening auf Histidin-Protonierung und rotamere Zustände reagiert. In vielen computergestützten biophysikalischen Studien werden die Protonierungszustände der titrierbaren Reste mit verschiedenen pKa-Vorhersageprogrammen bestimmt. Um die Leistung dieser Programme zur Identifizierung des Rezeptormodells mit der besten Vorhersagekraft beim Docking zu bewerten, verglichen wir die pKa-Vorhersageergebnisse von His62 und His119 aus PROPKA, Maestro, H++ und MCCE, wie in Tabelle 3 gezeigt, mit den berechneten pKa-Werten.

Erstens sagt PROPKA 3.1 voraus, dass sowohl His62 als auch His119 neutral sind, unabhängig von der Anwesenheit von TRH bei der Herstellung. Das Programm kann jedoch keine rotameren Zustände von Histidinen zuordnen. Daher muss ein Zustand von HID, flipped HID, HIE oder flipped HIE manuell bestimmt werden. Ähnlich wie PROPKA findet auch das Programm H++, das eine Ein-Struktur-Kontinuumselektrostatik verwendet, beide Histidine als neutral, obwohl die vorhergesagten pKa-Werte von denen von PROPKA abweichen. Das Programm MCCE, das auf einer Multikonformations-Kontinuumselektrostatik basiert, sagt His62 als neutral und His119 als protoniert voraus.

Als nächstes haben wir den Protein Preparation Wizard in Maestro verwendet, um pKa von His62 und His119 mit und ohne TRH zu berechnen. Beachten Sie, dass Maestro in der Lage ist, rotamere Zustände zu variieren, während PROPKA dies nicht kann. Ein kürzlich durchgeführtes Update ermöglicht es Maestro, PROPKA anstelle von Epik für seine pKa-Vorhersage zu verwenden. Mit Epik sagt Maestro sowohl His62 als auch His119 in doppelt protonierten Zuständen voraus, unabhängig von der Anwesenheit von TRH. Interessanterweise hat das Rezeptormodell, das diesem Multi-Histidin-Zustand entspricht, die schlechteste Vorhersagekraft mit einer AUC von 0,869. Bei Verwendung von PROPKA werden HIP62 und HIE119 für den Protein-TRH-Komplex und HIE62 und HIE119 für das Apo-Protein vorhergesagt. Diese beiden Vorhersagen von PROPKA in Maestro entsprechen den Modellen mit mäßiger Anreicherungsleistung, mit AUCs von 0,971 für Modell 25 (HIP62 und HIE119) bzw. 0,942 für Modell 1 (HIE62 und HIE119).

Angesichts der Tatsache, dass die oben genannten Vorhersagen, die von verschiedenen Softwareprogrammen gemacht wurden, erheblich voneinander abweichen, sollte man vorsichtig sein, wenn man diese Ergebnisse als Richtlinie für die Vorbereitung eines Proteins für das virtuelle Screening verwendet. Ohne genaue Kenntnis des tatsächlichen Protonierungszustands des Rezeptors sowie der zu untersuchenden Liganden ist es schwierig, dieses Problem zu lösen. Daher schlagen wir vor, dass eine Analyse in kleinem Maßstab, wie sie in dieser Studie durchgeführt wurde, und ein Vergleich mit experimentellen Daten, sofern verfügbar, eine genauere Beschreibung der Protonierung und des Rotameriezustands der titrierbaren Reste in Proteinrezeptoren für zukünftige Screenings in größerem Maßstab liefern könnte. Alternativ könnte ein Modell, das die explizite Einbeziehung alternativer Seitenketten-Protonierungs- und Rotamerie-Zustände während des Dockings beinhaltet, möglicherweise mit im Raster gespeicherten Informationen, wie sie für rotierbare Hydroxylgruppen und Thiole in Glide existieren, weiterverfolgt werden. Die Prüfung der Ergebnisse hinsichtlich der Protonierungszustände und der Rangfolge auf der Grundlage der Wechselwirkungen mit Histidinen sollte sorgfältig untersucht werden, bevor experimentelle Tests durchgeführt werden.

Außerdem wird die Flexibilität des Rezeptors wahrscheinlich die Protonierungszustände der ionisierbaren Reste beeinflussen. Obwohl dies hier nicht explizit untersucht wurde, ist die Proteinflexibilität – abgesehen von der Minimierung der einzelnen Rezeptoren nach der Zuordnung der Protonierungszustände – für das Design und die Entwicklung von Arzneimitteln eindeutig wichtig. Die gleichzeitige Betrachtung von Konformations- und Protonierungsraum wird mit physikalischen Methoden wie den hier beschriebenen schnell unüberschaubar, aber verbesserte Sampling-Methoden sind vielversprechend, um solche Schwierigkeiten zu bewältigen. Dazu gehören Molekulardynamiksimulationen mit konstantem pH-Wert, bei denen der pH-Wert eine externe thermodynamische Variable ist, die für die blinde Vorhersage der pKa-Werte der titrierbaren Reste verwendet wird. Die wirksame Anwendung der Ergebnisse dieser Simulationen auf das Moleküldesign ist ein aktuelles Forschungsgebiet. Gleichgewichtsensembles aus solchen Simulationen können in Verbindung mit Docking als Anwendung des entspannten komplexen Schemas verwendet werden, bei dem ein virtuelles Screening mit einem Ensemble unterschiedlich protonierter Strukturen durchgeführt wird, um die Anreicherungsergebnisse zu verbessern. Die Berücksichtigung der Rezeptorflexibilität bei der Vorbereitung des Targets wird zu einer breiteren Abtastung des Konformations- und Protonierungsraums führen und damit die Leistung von VS verbessern.