Bakterielle Co-Kultur mit Zellsignalübersetzer- und Wachstumssteuerungsmodulen für eine autonom regulierte Kulturzusammensetzung

AI-1-Signal gesteuerte Zellwachstumsrate

Wir testeten zunächst die Steuerung der Zellwachstumsrate von E. coli durch die transkriptionelle Regulierung von ptsH, einem am Zuckertransport beteiligten Gen. HPr (kodiert von ptsH) ist weithin bekannt als eines einer Reihe von Proteinen (z. B. E1, HPr, EII), die nacheinander eine Phosphorylgruppe von Phosphoenolpyruvat (PEP) auf Glukose (oder ein anderes PTS-Kohlenhydrat) übertragen34. HPr ist hoch konserviert37. Wir haben kürzlich entdeckt, dass HPr mit der AI-2-Kinase LsrK interagiert und die AI-2-Aufnahme beeinflusst35. Diese AI-2-modulierende Funktion haben wir uns später bei der Konstruktion der AI-2-Sensorzelle zunutze gemacht. Hier konnten wir zeigen, dass ptsH-Mutantenstämme in glukosehaltigen Minimalmedien langsamer wachsen als Wildtyp-Stämme (ergänzende Abb. 1a). Wenn ptsH in einer ptsH-Mutante unter einen IPTG-induzierbaren Promotor gesetzt wurde, konnte die Wachstumsrate durch die Zugabe von IPTG gesteuert werden (ergänzende Abb. 1b). Wir konnten zeigen, dass die Induktion der Expression von ptsH zu einem Anstieg der Wachstumsrate der Zellen führt. Ebenso wichtig ist, dass dieses Verhalten unabhängig davon ist, ob das Medium Glukose als Hauptkohlenstoffquelle enthält oder nicht (ergänzende Abb. 1c).

Auf der Grundlage dieses Konzeptnachweises haben wir als Nächstes eine QS-Signal-gesteuerte Wachstumsrate entwickelt. Um den Kontrollstamm zu konstruieren, wurde ptsH unter Kontrolle des AI-1 lasI QS-Promotors auf dem Plasmid pAHL-HPr (Abb. 2a) in einem ptsH-Mutantenstamm PH04 platziert. An anderer Stelle auf dem Plasmid wurden sowohl dsRedExpress2, das der Zellvisualisierung dient, als auch LasR, das für die Aktivierung des lasI-Promotors erforderlich ist, unter einem konstitutiven T5-Promotor exprimiert. Die Zugabe von AI-1 zum Controller-Stamm steigerte die Wachstumsrate der Zellen dosisabhängig auf das bis zu 1,8-fache der Basiswachstumsrate (Abb. 2b). Die gemessene spezifische Wachstumsrate (zwischen 1 und 4 h nach AI-1-Zugabe) diente als Grundlage für ein Monod-Modell der Wachstumsrate auf der Basis des AI-1-Spiegels (Abb. 2c).

AI-1 moduliert die Zusammensetzung in Controller-Zell-Kokulturen

Die AI-1-regulierten Controller-Zellen wurden dann mit anderen Stämmen ko-kultiviert, um zu überprüfen, ob die Zugabe von AI-1 die Zusammensetzung der Ko-Kultur verändert. Wachstumsreglerzellen, die ein rot fluoreszierendes Protein exprimieren (PH04 pAHL-ptsH), wurden entweder mit PH04 pCT6 oder TOP10 pT5G7 ko-kultiviert. PH04 pCT6 hat eine ähnliche Basiswachstumsrate wie PH04 pAHL-ptsH, während TOP10 pT5G deutlich schneller wächst. Die Kulturen wurden mit annähernd gleichen Zelldichten beimpft und mit unterschiedlichen AI-1-Konzentrationen ergänzt. Nach 8 Stunden wurden Proben für die Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie entnommen und mit ImageJ quantifiziert. Wenn die Kontrollzellen mit PH04 kultiviert wurden, nahm die Kulturzusammensetzung der Kontrollzellen erwartungsgemäß mit steigender AI-1-Konzentration zu (Abb. 3a). Ein ähnlicher Trend wurde beobachtet, wenn Zellen mit TOP10 kultiviert wurden, trotz der schnelleren Wachstumsrate von TOP10 (Abb. 3b). Das heißt, dass in Ko-Kulturen ohne AI-1 der Anteil der Kontrollzellen in den TOP10-Ko-Kulturen während der folgenden 8 Stunden von anfänglich ~0,5 auf ~0,09 deutlich abnahm. Die Zugabe von AI-1 wirkte diesem Unterschied in der Wachstumsrate entgegen und führte zu einem höheren Anteil an Kontrollzellen während desselben 8-Stunden-Zeitraums. Diese Ergebnisse zeigen, dass AI-1 (das kein QS-Signalmolekül von E. coli ist) unabhängig von anderen Stämmen in der Kultur und ihren jeweiligen Wachstumsraten die Wachstumsrate des manipulierten Controller-Stamms moduliert, und dass die Änderung ausreichend schnell eintrat, um eine beobachtbare Änderung der Kulturzusammensetzung zu ermöglichen – sogar unter relativ kurzfristigen Batch-Bedingungen (im Gegensatz zu Fed-Batch-, wiederholten Batch- oder kontinuierlichen Kulturen).

Als nächstes wurde der AI-1-regulierte Kontrollstamm mit Zellen kultiviert, die AI-1 produzieren, wenn sie induziert werden. PH04 pSox-LasI und PH04 pAHL-HPr wurden zusammen ko-gezüchtet. Das Plasmid pSox-LasI enthält lasI, das AI-1 synthetisiert, unter dem Pyocyanin-induzierbaren soxS-Promotor7. In diesem Experiment erhält der Controller-Stamm ein Signal von einem Translater-Stamm, der seinerseits als Reaktion auf Pyocyanin AI-1 produziert. Auf diese Weise wird gezeigt, dass das Co-Kultur-Kontrollschema auf einen bestimmten molekularen Hinweis reagiert. In diesem Fall wurde jede Kultur mit annähernd gleichen Ausgangsdichten beimpft und die Co-Kulturen wurden entweder Pyocyanin ausgesetzt oder nicht. Exponierte Kulturen zeigten innerhalb von 5 Stunden eine erhöhte Produktion von AI-1 und eine entsprechend erhöhte Zusammensetzung von PH04 pAHL-HPr (Abb. 3c). Diese Ergebnisse zeigen, dass AI-1, das von einem anderen Stamm produziert wird, die Wachstumsrate des Kontrollstammes modulieren kann, und dass dies in Zeiträumen geschehen kann, die erforderlich sind, um Veränderungen in einem Batch-Prozess zu bewirken. Darüber hinaus zeigt dies die potenzielle Machbarkeit einer anwendergesteuerten Co-Kultur auf der Grundlage einer anwenderspezifischen Anwendung eines Moleküls oder Induktors, in diesem Fall Pyocyanin. Als Nächstes haben wir den Translator-Stamm entwickelt, um eine autonom regulierte Ko-Kultur zu schaffen, die auf dem allgegenwärtigen AI-2-Signalmolekül basiert.

Entwicklung von AI-2-erfassenden Translator-Zellen

Um Zelllinien zu konstruieren, die AI-2 erfassen und AI-1 produzieren, haben wir Stämme entwickelt, die die Expression von LasI aktivieren, das AI-1 synthetisiert, wenn der AI-2 lsr-Promotor aktiviert wird. Wir verwendeten ein Zwei-Plasmid-System, um die Expression des schwachen lsr-Promotors zu verstärken25 (Abb. 4a). Kurz gesagt, AI-2 wird durch LsrK phosphoryliert, und phosphoryliertes AI-2 hebt die Unterdrückung des Promotors durch LsrR auf, wodurch die Transkription der lsr-Transportergene erhöht und die AI-2-Aufnahme beschleunigt wird. Gleichzeitig führt die AI-2-vermittelte Aktivierung des lsr-Promotors zur Transkription der T7-RNA-Polymerase aus dem Plasmid pCT6 und zur anschließenden Transkription von lasI aus dem Plasmid pET-LasI.

Das System wurde zunächst in dem E. coli-Wirtsstamm CT104 konstruiert, der eine luxS-Mutante ist (d. h. unfähig, AI-2 zu produzieren). CT104 fehlt auch lsrFG, das für den Abbau des phosphorylierten AI-2-Signals verantwortlich ist und die Empfindlichkeit der Zelle gegenüber AI-238 erhöht. Wir konnten nachweisen, dass diese Zelllinie, CT104 pCT6 pET-LasI, AI-1 produzierte, wenn sie in konditionierten Medien (CM) von AI-2 produzierenden BL21 kultiviert wurde (ergänzende Abb. 2). BL21 wurden in unterschiedlichen Zelldichten kultiviert, CM wurde gesammelt und CT104-Zellen wurden in dem gesammelten CM kultiviert. Wichtig ist, dass das von den CT104-Zellen produzierte AI-1 mit der Dichte der AI-2 produzierenden BL21-Zellen korrelierte (ergänzende Abb. 2a). Wir testeten auch, ob Translatorzellen, die zu Konsortien mit unterschiedlichen Anteilen an AI-2-produzierenden Zellen hinzugefügt wurden, das AI-1-Signal in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Konsortien produzieren konnten. CT104-Zellen wurden zu Kulturen mit unterschiedlichen Verhältnissen von BL21 (luxS+) zu BL21 ΔluxS hinzugefügt. Nach 6 Stunden war die Höhe des AI-1-Signals in den extrazellulären Medien ein Indikator für die Zusammensetzung der Kultur, die wiederum in erster Linie auf der anfänglichen Fraktion von luxS+-Zellen beruht25 (ergänzende Abb. 2b).

Die oben genannten Experimente zeigten, dass eine Zelllinie konstruiert werden kann, die AI-1 als Reaktion auf AI-2 aus AI-2-produzierenden Zellen produziert. Diese Experimente wurden in LB-Medien und nicht in Medien mit Glukose durchgeführt. Das Vorhandensein von Glukose hemmt die Aufnahme von AI-2 und die Aktivität des Isr-Promotors39 , so dass die Verwendung der CT104-Zellen möglicherweise auf Medien ohne Glukose beschränkt werden könnte (siehe ergänzende Abb. 3 für das Schema des AI-2-QS-Wegs). Auf der Grundlage unserer Kenntnisse über das AI-2 QS-System haben wir versucht, einen Stamm zu entwickeln, der in der Lage ist, AI-2 aufzunehmen und den lsr-Promotor in glukosehaltigen Medien zu aktivieren. Auf diese Weise könnten unsere Ergebnisse allgemeiner angewendet werden. Zuvor hatten wir nachgewiesen, dass HPr (kodiert durch ptsH) mit LsrK interagiert und die Kinaseaktivität von LsrK hemmt, und dass ptsH-Mutanten AI-2 auch in glukosehaltigen Medien aufnehmen35. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die Verwendung von PH04 (ΔptsH ΔluxS) als Wirtsstamm eine AI-2-basierte Produktion von AI-1 in glukosehaltigen Medien ermöglichen würde. Wir testeten die Translatorzellen mit beiden Wirtsstämmen in LB- und M9-Glucosemedien mit und ohne AI-2. Die Menge des produzierten AI-1 war abhängig von der Zugabe von AI-2, aber auch vom Wirtsstamm und dem Medium (Abb. 4b). Beide Stämme produzierten AI-1, wenn die Zellen zu LB-Medien mit AI-2 gegeben wurden. Wie erwartet, führte die Verwendung des CT104-Wirtsstamms in M9-Medien zu einer geringen oder unbedeutenden Veränderung der AI-1-Aktivität im Vergleich zwischen Kulturen mit und ohne AI-2. Die PH04-Übersetzerzellen zeigten jedoch eine durch AI-2 aktivierte Produktion von AI-1 in M9 + Glukosemedien. Auf diese Weise konnte das entwickelte System in glukosehaltigen Medien eingesetzt werden.

Charakterisierung von PH04-Translatorzellen

PH04-Translatorzellen nehmen das AI-2-Signalmolekül auf, leiten das Signal durch Aktivierung der Expression von LasI weiter und synthetisieren und sezernieren AI-1. Der gewünschte AI-1-Output ist dann eine Funktion des AI-2-Inputs. Wir haben die durch AI-2 signalisierte Produktion von AI-1 im PH04-Translatorstamm im Laufe der Zeit und für eine Reihe von biologisch relevanten AI-2-Konzentrationen charakterisiert. Die Geschwindigkeit der AI-1-Produktion durch PH04-Translatorzellen erwies sich als dosisabhängig von AI-2 (Abb. 5a). Wir stellen fest, dass AI-2 unter diesen und ähnlichen Bedingungen meist innerhalb von 4 Stunden verbraucht wird (Abb. 5b). Die Zugabe von AI-2 oder die auf AI-2 basierende Produktion von AI-1 in diesen Batch-Kulturen führte zu keiner beobachtbaren Abnahme des Zellwachstums (Abb. 5c). Anschließend charakterisierten wir die Geschwindigkeit der AI-1-Produktion pro Zelle über die Zeit für jede getestete AI-2-Konzentration, indem wir eine logistische Funktion durch die AI-1-Daten zeichneten, die Ableitung dieser Gleichung über die Zeit bestimmten und die Ableitung durch die Zelldichte über die Zeit teilten (ergänzende Tabelle 1), was eine zeitabhängige spezifische Produktionsrate ergab. Die sich daraus ergebenden Diagramme (Abb. 5d) zeigen die geschätzte AI-1-Produktionsrate pro Zelle als Funktion des zugesetzten AI-2 und der Zeit nach der AI-2-Zugabe. Wie später gezeigt wird, stimmt dies mit einer Beobachtung überein, die wir gemacht haben, nämlich dass der Verlauf der Genexpression als Reaktion auf einen anfänglichen Hinweis ziemlich robust ist21,38,40.

Als Nächstes wurde die Wirkung des von den PH04-Übersetzerzellen produzierten AI-1 auf die Wachstumsrate der auf AI-1 reagierenden Controller-Zellen getestet. Das heißt, wachstumsempfindliche Zellen wurden zu CM hinzugefügt, das AI-1 von Translatorzellen enthielt, die unterschiedlichen Mengen von AI-2 ausgesetzt worden waren, und für ~3 h kultiviert (ergänzende Abb. 4a). Über das hinaus, was in Abb. 5 gezeigt wurde, wo AI-1 durch direkte Exposition mit AI-2 erzeugt wird, zeigt dieses Experiment, dass die Zellübersetzung von AI-2 in AI-1 mit der notwendigen Expression und Zellkulturdynamik erfolgen kann, um die Wachstumsrate der zweiten Population zu beeinflussen (ergänzende Abb. 4b). Diese Beobachtung wurde in späteren Co-Kultur-Experimenten noch dramatischer.

Autonome Regulierung der Co-Kultur-Zusammensetzung

Als nächstes fügten wir die Translator-Zellen (als Population A bezeichnet) und die auf AI-1 reagierenden Controller-Zellen (Population B) zu Lösungen mit einer Reihe von AI-2-Ausgangskonzentrationen hinzu. In Ko-Kulturen aus Translatorzellen und Controllerzellen regulieren die Translatorzellen die Zusammensetzung der Konsortien autonom auf der Grundlage des anfänglichen AI-2-Spiegels. In der ergänzenden Abb. 5 führten die Ko-Kulturen mit erhöhtem AI-2-Anfangsspiegel zu einem Anstieg von AI-1 (ergänzende Abb. 5b) und einer entsprechenden Zunahme der relativen Häufigkeit von Population B (ergänzende Abb. 5a). Diese Ergebnisse belegen das Konzept der signalvermittelten autonomen Kontrolle der Konsortienpopulation. Wichtig ist, dass die geschätzten Wachstumsraten für die Population A und die Population B mit den erwarteten Wachstumsraten übereinstimmten, die während der Monokulturexperimente gemessen wurden (ergänzende Abb. 5c).

Nachdem wir gezeigt hatten, dass die Translatorzellen die Zusammensetzung der Konsortien auf der Grundlage der Exposition gegenüber AI-2 regulieren können, entwickelten wir ein mathematisches Modell, um die Systemdynamik zu beschreiben. Auf diese Weise lässt sich das Verhalten der Co-Kultur bei bestimmten Ausgangsbedingungen, Wachstumsraten usw. vorhersagen, um die Parameter zu bestimmen, die zur Erzielung des gewünschten Ergebnisses erforderlich sind. Dieses konzeptionell einfache mathematische Modell wurde erstellt, um das Verhalten der Co-Kultur anhand der Daten der einzelnen Stämme vorherzusagen. Das Modell besteht aus vier gewöhnlichen Differentialgleichungen, eine für jede Populationsdichte, Substratkonzentration und AI-1-Konzentration (siehe ergänzende Tabellen 2 und 3). Zur Modellierung des Zellwachstums und der Substratkonzentration wurde die Monod-Wachstumskinetik mit einem konstanten Ertragskoeffizienten verwendet, wobei zusätzliche Funktionen die Produktion und/oder die Auswirkungen der QS-Moleküle berücksichtigen. Das von Population A produzierte AI-1 basiert sowohl auf der Höhe der AI-2-Exposition als auch auf der Zeit (fAI1). In einer früheren Arbeit38 haben wir festgestellt, dass zeitabhängige Trajektorien des Zellverhaltens eine Folge der anfänglichen Exposition gegenüber dem Autoinduktor sind, so dass zeitabhängige Funktionen der AI-1-Produktion hier plausibel wären. Die Wachstumsrate von Population B wurde auf der Grundlage des vorherrschenden AI-1-Niveaus (fHPr) formuliert. Die maximalen spezifischen Wachstumsraten wurden anhand experimenteller Daten gemessen, die Ausbeuten wurden auf der Grundlage der experimentell beobachteten Dichte in der stationären Phase und der bekannten anfänglichen Substratkonzentrationen geschätzt, und die K1- und K2-Werte wurden auf der Grundlage von Literaturwerten für Glukose gewählt. Der MATLAB (Version R2016a) ode45-Löser wurde zur Lösung des ODE-Systems verwendet. Das Modell kann verwendet werden, um zu zeigen, wie sich eine Co-Kulturpopulation angesichts dieser einfachen phänomenologischen Ratengleichungen und Best-Fit-Konstanten im Laufe der Zeit verändern wird. Wie bereits erwähnt, bildet dies die Grundlage für die Bestimmung, ob die Entwicklung einer Co-Kultur über die begrenzte Zeit, die in einer Batch-Kultur zur Verfügung steht, überhaupt vorhergesagt werden kann. Wichtig ist, dass unsere Ergebnisse aus Monokulturen zur Simulation von experimentellen Ergebnissen aus Co-Kulturen verwendet werden.

Das heißt, wir haben als nächstes die autonom programmierte Steuerung von Co-Kulturen anhand von Modellvorhersagen bewertet. Ko-Kulturen der Populationen A und B wurden für eine Reihe von anfänglichen Zellpopulationen zusammengesetzt und dann zu Medien mit vorgeschriebenen Mengen an AI-2 hinzugefügt, um eine Populationsbahn in Gang zu setzen. In unserem System wird die anfängliche Zusammensetzung auf der Grundlage des Verhältnisses der in die Co-Kultur eingebrachten Zellen ausgewählt, und dann wird die Kulturzusammensetzung im Laufe der Zeit auf der Grundlage des AI-2-Gehalts in den Medien selbständig angepasst. Wir haben die Ergebnisse mit unserem Modell verglichen. In Abb. 6 sind die Zusammensetzung der Co-Kultur und der AI-1-Gehalt nach 5 Stunden für eine Reihe von Bedingungen dargestellt, darunter verschiedene anfängliche A:B-Verhältnisse und AI-2-Gehalte. Bei diesen Tests wurde eine Ausgangszelldichte der Population verwendet. Wichtig ist, dass unser Modell die experimentellen Ergebnisse sowohl für den AI-1-Gehalt als auch für die Zusammensetzung der Co-Kultur gut vorhersagte. Wir stellen außerdem fest, dass das Modell zur Auswahl von Ausgangsbedingungen verwendet werden kann, die zu einem gewünschten Ergebnis führen. Um beispielsweise eine Population B mit einer relativen Zelldichte von 55 % nach 5 Stunden zu erreichen, könnte die Co-Kultur mit einem anfänglichen A:B-Verhältnis von 60:40 und einer AI-2-Konzentration von 40 µM gestartet werden. Andere Szenarien wurden, wie dargestellt, getestet und validiert. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass sowohl die anfängliche Zellzusammensetzung (z. B. das Verhältnis von A:B) als auch die Exposition gegenüber verschiedenen AI-2-Konzentrationen die Entwicklung der Population in der Ko-Kultur beeinflussen. Ebenso wichtig ist jedoch, dass sich das orthogonale Signalmolekül, AI-1, wie modelliert verhielt. Wir gehen davon aus, dass die Einbeziehung dieses und anderer Translatorsignale die Entwicklung und/oder Kontrolle weiterer, vielfältiger oder komplizierterer Konsortien ermöglichen wird.

Das heißt, dass wir das Co-Kultur-Steuerungssystem getestet haben, indem wir es einer AI-2-Konzentration, 80 µM, ausgesetzt haben, die höher war als die AI-2-Konzentrationen, die zur Charakterisierung der Translatorzellen verwendet wurden und für die wir kein Modell hatten. Wir verwendeten die Ergebnisse der Co-Kultur (Abb. 6), um das Verhalten der Translatorzellen in einer Monokultur bei dieser AI-2-Konzentration abzuschätzen. Anschließend führten wir Monokulturexperimente durch, indem wir den Translatorzellen 80 µM AI-2 zusetzten, und zeigten, dass wir in der Lage waren, das Verhalten der Monokultur anhand der Co-Kulturdaten und des Modells vorherzusagen. Ergänzende Abb. 6a zeigt die aus den Co-Kultur-Daten und dem Modell vorhergesagte Rate der AI-1-Produktion (Linie) und die tatsächliche Rate der AI-1-Produktion während des Monokultur-Experiments (Datenpunkte). Die ergänzende Abb. 6b zeigt die vorhergesagten AI-1-Konzentrationen in der Monokultur im Vergleich zu den tatsächlich gemessenen AI-1-Konzentrationen. Der vorhergesagte AI-1-Gehalt wurde mit Hilfe des Modells bestimmt, indem die geschätzte AI-1-Produktionsrate und die anfängliche Zelldichte der Monokultur eingegeben wurden.

Zuletzt testeten wir unser Co-Kultur-System über einen längeren Zeitraum mit wiederholter Batch-Fütterung mit mehrfachen AI-2-Zugaben (Abb. 7). Unser Ziel war es, die Populationsentwicklung über diejenige hinaus zu verlängern, die durch die Variation der anfänglichen Zusammensetzung und die Exposition gegenüber einer festen AI-2-Konzentration in einer einfachen Batch-Kultur erreicht wurde. Auf diese Weise testen wir die Robustheit des Kontrollsystems. In Abb. 6 haben wir zum Beispiel festgestellt, dass wir bei Kulturen mit einem anfänglichen Anteil von ~40 % der Population B nur Werte von annähernd 60 % der Population B erreichen konnten, und das auch nur, wenn wir hohe AI-2-Konzentrationen (>80 μM) ausgesetzt waren. Indem wir ein System mit wiederholten Ansätzen testeten, dachten wir, dass wir die B-Population auf über 80 % bringen könnten, indem wir das System einfach wieder aussetzen und zeitlich verlängern. Wir gaben unsere Co-Kultur in Medien mit unterschiedlichen AI-2-Konzentrationen und resuspendierten die Zellen alle 3 Stunden in frischen Medien mit zusätzlichem AI-2. Unmittelbar vor jeder Resuspendierung wurden Proben für die Analyse der AI-1-Konzentration und der Zusammensetzung der Zellkultur genommen (Abb. 7a, b). Die Zelldichte und die AI-2-Aktivität wurden ebenfalls gemessen (ergänzende Abb. 7). Wir stellten fest, dass das System bei diesem komplexeren Versuchsaufbau im Allgemeinen wie vorgesehen funktionierte. Wir fanden heraus, dass wir durch die Exposition gegenüber geringeren Mengen von AI-2 (20 und 40 μM) fast 80 % der Population B erreichen konnten. Während dieses Tests stellten wir jedoch fest, dass unsere experimentellen Ergebnisse von den durch unser mathematisches Modell vorhergesagten Ergebnissen abwichen. Wir untersuchten die AI-1-Produktion und die Wachstumsrate der Kulturen während jedes 3-Stunden-Segments genauer, um ein Verständnis der Kulturdynamik auf der Grundlage der beobachteten Divergenz mit dem einfachen Modell zu erlangen. So war beispielsweise die AI-1-Produktion während des zweiten und dritten 3-Stunden-Zyklus höher als vom Modell vorhergesagt. Im Nachhinein ergab dies einen Sinn, weil die Zellen nach dem ersten Batch-Zyklus bereits LasI (das AI-1 synthetisiert) produziert hatten und das zusätzliche AI-2 wahrscheinlich eine weitere Produktion von LasI auslöste (wir haben LasI nicht mit einem Abbau-Tag versehen, so dass seine Aufrechterhaltung zu erwarten gewesen wäre). Wir haben dann das Modell so angepasst, dass die AI-1-Produktionsrate zu Beginn jeder nachfolgenden Resuspension in neuen Medien die gleiche war wie am Ende des vorherigen Zyklus (Abb. 7c, durchgezogene Linien). Die Einbeziehung dieser neuen Funktionen für die AI-1-Produktion in das Modell führte zu Werten für AI-1, die den experimentellen AI-1-Daten sehr nahe kamen (Abb. 7a, Modell in durchgezogenen Linien). In ähnlicher Weise schätzten wir die Wachstumsrate der Controller-Zellen (siehe ergänzende Anmerkung 1) und stellten fest, dass die Wachstumsrate in Kombination mit den AI-1-Konzentrationen nicht zu unserer früheren fAI1-Funktion passte (Abb. 7d). Wir weisen darauf hin, dass wir bei der Berechnung der Wachstumsrate der Controller-Zellen davon ausgingen, dass die Wachstumsrate der Translator-Zellen konstant blieb, obwohl sie durch die wiederholte Zugabe von AI-2 leicht abgenommen haben könnte. Während die Wachstumsrate der Controller-Zellen anfänglich in Abhängigkeit von AI-1 zu steigen schien, nahm die Wachstumsrate bei den nachfolgenden Resuspensionen in frischen Medien insgesamt ab. Wir hatten bereits früher eine dynamische Abnahme der Wachstumsrate bei der Überexpression von HPr und LasI festgestellt (ergänzende Abbildungen 4 und 5). Hier vermuten wir, dass entweder eine metabolische Belastung der Zellen durch wiederholte Exposition gegenüber hohen AI-1-Konzentrationen oder reduzierte Substrat- oder Nährstoffkonzentrationen die Ursache für das verringerte Wachstum während der späteren Zyklen gewesen sein könnten. Indem wir unser Modell so anpassten, dass die Wirkung von AI-1 auf die Wachstumsrate mit der Zeit abnahm (siehe Anmerkung 2), konnten wir unsere experimentellen Daten anpassen (Abb. 7b, angepasstes Modell in durchgezogenen Linien), ohne die Komplexität des Modells zu erhöhen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser Co-Kultur-System wie vorgesehen reagierte, unabhängig davon, ob es in Medien ohne AI-2 oder mit einer hohen AI-2-Konzentration platziert wurde. Außerdem zeigten unsere Ergebnisse kontrollierbare Populationsdichten, die sich auf 40 bis 80 % der Kontrollzellen erstreckten. Auch der Vergleich mit unserem ursprünglichen Modell gab Aufschluss darüber, wie sich das System in diesem komplexeren Versuchsaufbau verhielt; die Translator-Zellen schienen im Laufe der Zeit höhere Mengen an AI-1 zu produzieren, während die Controller-Zellen offenbar geringere AI-1-regulierte Veränderungen der Wachstumsrate im Laufe der Zeit aufwiesen.

Schließlich könnte das Modell eine Grundlage bieten, um in silico zu erforschen, wie die hier verwendeten Strategien für autonom regulierte Kulturen (die durch eine signalregulierte Wachstumsrate und eine native Zell-Zell-Signalübertragung gekennzeichnet sind) auf andere Systeme ausgeweitet werden könnten, einschließlich benutzerregulierter oder programmierbarer Systeme, die dynamisch gesteuert werden könnten. Beispielsweise unterscheiden sich Chemostat-Kulturen von dem derzeitigen autonomen System dadurch, dass ihre Ergebnisse durch benutzerdefinierte Eingaben, wie die Verdünnungsrate, gesteuert werden. In einem ersten Durchgang haben wir Simulationen von Chemostat-Kokulturen durchgeführt, indem wir dem Batch-Modell die Standard-Flussbedingungen hinzugefügt haben (ergänzende Abb. 8, ergänzende Tabellen 4 und 5). In einigen Fällen stellte sich heraus, dass die Verdünnungsrate eine stationäre Kulturzusammensetzung definiert, die wiederum innerhalb eines durch die Verdünnungsrate begrenzten Bereichs „abgestimmt“ werden kann. Dieses „Tuning“ kann durch externe Modulation der Zell-Zell-Signalübertragung erreicht werden, z. B. durch exogene Zugabe von Signalmolekülen. Diese Fälle zeigen, wie das Zusammenspiel zwischen unserem autonomen System und anderen benutzergesteuerten Systemen zu komplexeren Populationsverläufen führen kann. Unsere Simulationsergebnisse dienen hier als konzeptioneller Rahmen für die Steuerung der Konsortienzusammensetzung in komplexeren, benutzergesteuerten Systemen. Weitere Erläuterungen zu den Chemostat-Simulationen finden sich in der ergänzenden Anmerkung 3.