Cystintransport und Cystinosin
Cystin sammelt sich in den Lysosomen von cystinotischen Leukozyten14 und Fibroblasten an.44 Chloroquin und andere Inhibitoren des lysosomalen Proteinabbaus vermindern die Wiederanreicherung von Cystin in abgereicherten cystinotischen Zellen, was darauf hindeutet, dass der intrazelluläre Proteinabbau die Quelle des überschüssigen Cystins ist.45 Der Cystingehalt normaler und cystinotischer Zellen kann auch durch Beladung mit Cystindimethylester46 oder Cystein-Glutathion-Mischdisulfid44 erhöht werden; insbesondere ist jedoch der Ausfluss von Cystin aus den Lysosomen in cystinbeladenen cystinotischen Zellen deutlich beeinträchtigt.44,46 Der Cystin-Efflux aus Zellen, die von heterozygoten Trägern des nephropathischen Cystinose-Gens stammen, ist im Vergleich zu Wildtyp-Zellen nicht signifikant beeinträchtigt.44 Die Messung des Cystin-Cystin-Gegenstromtransports in lysosomalen Granula zeigt jedoch eindeutig, dass dieser bei homozygoten Patienten fehlt, wobei die Werte bei heterozygoten Trägern etwa halb so hoch sind wie bei normalen Kontrollzellen47; ein defekter lysosomaler Cystin-Transport ist somit der ursächliche Defekt bei der Cystinose.
Die biochemische Diagnose sowohl von Patienten48 als auch von heterozygoten Trägern49 war entscheidend für die Feinkartierung des Cystinose-Gens auf Chromosom 17p13. Ein entscheidender Durchbruch war der Nachweis genomischer Deletionen für einen verknüpften Mikrosatellitenmarker, gefolgt von der Identifizierung des CTNS-Gens innerhalb des minimalen Deletionsintervalls.50 Das CTNS-Gen umfasst 12 Exons, die für ein 367-Aminosäuren-Protein namens Cystinosin kodieren. Cystinosin besteht aus sieben Transmembrandomänen, einem N-Terminus mit 128 Aminosäuren, der sieben Glykosylierungsstellen enthält, und einem zytosolischen C-Terminus mit 10 Aminosäuren. Alle Patienten mit den verschiedenen Subtypen der Zystinose scheinen eine Mutation im CTNS-Gen zu haben (d. h. es gibt bisher keine Hinweise auf eine genetische Heterogenität). Die häufigste Mutation ist eine 57-kb-Deletion, die die 5′-Region stromaufwärts von Exon 1051,52 verschiebt; über 70 % der Patienten mit nephropathischer Zystinose nordeuropäischer Abstammung sind homozygot für diese Mutation.5254 Bendavid und Kollegen haben Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungssonden für diese große Deletion entwickelt, die ersten ihrer Art für eine lysosomale Speicherkrankheit.55 Separate mutmaßliche Gründereffekt-Mutationen wurden in Französisch-Kanada56 (W138X, irischer Herkunft) und in der französischen Provinz Bretagne57 (eine Spleißstellenmutation am Ende von Exon 8) identifiziert. Eine rezidivierende Missense-Mutation (G339R) wurde in zwei bestimmten ethnischen Populationen identifiziert: in zwei nicht verwandten Familien amisch-mennonitischer Abstammung und in fünf nicht verwandten Familien jüdisch-marokkanischer Herkunft.58-61 Darüber hinaus wurden 50 weitere CTNS-Mutationen identifiziert, darunter mindestens drei Patienten mit Mutationen in der Promotorregion des Gens.62 Patienten mit juveniler oder okulärer Cystinose sind homozygot für eine „mildere“ Mutation, typischerweise eine Punktmutation ohne Störung des offenen Leserasters; alternativ sind diese Patienten compound heterozygot für eine milde Mutation und eine schwerere Mutation.17,59
Cystinosin wird weithin exprimiert, wobei das Transkript in Bauchspeicheldrüse, Muskeln und Nieren besonders reichlich vorhanden ist.50 Die Immunhistochemie mit Anticystinosin-Antikörpern63 und die Transfektion von Zellen mit Epitop-getaggter komplementärer DNA (cDNA)64,65 zeigen, dass das Protein in Lysosomen exprimiert wird. Wie erwartet ist die Expression von Cystinosin im proximalen Nierentubulus besonders ausgeprägt.63 Die Lokalisierung von Cystinosin an der lysosomalen Membran hängt sowohl von einem Tyrosin-basierten GYDQL-Motiv zur lysosomalen Sortierung am C-terminalen Schwanz als auch von einem YFPQA-Pentapeptid innerhalb der fünften Intertransmembranschleife ab. Das YFPQA-Motiv ist insofern einzigartig, als es ein seltenes Beispiel für ein lysosomales Sortiersignal ist, das sich außerhalb des zytoplasmatischen Schwanzes befindet.64 Es scheint eine gewisse Fähigkeit zu besitzen, die Cystinosin-Sortierung allein zu retten, da eine Cystinosin-Mutante mit einem fehlenden GYDQL-Motiv, aber einem intakten YFPQA-Motiv immer noch teilweise in Lysosomen lokalisiert.65 Eine Minderheit von Cystinose-Mutationen beeinträchtigt die lysosomale Ausrichtung von Cystinosin, was auf eine primäre Störung des GYDQL-Motivs oder auf noch nicht näher charakterisierte Auswirkungen auf die Sekundärstruktur zurückzuführen ist.66
Bei der funktionellen Charakterisierung von Cystinosin wurde die Umleitung des Proteins zur Plasmamembran in einer Mutante, Cystinosin-.GYDQL, ausgenutzt, der das C-terminale GYDQL-Motiv fehlt.67 Cystinosin-.GYDQL fungiert somit als H+-gesteuerter Cystin-Transporter an der Plasmamembran von transfizierten Zellen. Es ist hochspezifisch für L-Cystin; andere Aminosäuren, insbesondere das Monosulfid Cystein, sind keine Substrate. Cystinosin ist sättigbar und folgt einer Michaelis-Menton-Kinetik mit einem Km für Cystin von ∼280 μM.67 Der Einwärtstransport wird durch einen sauren extrazellulären pH-Wert erheblich stimuliert (Abb. 14-6); der Zusammenbruch dieses transmembranen H+-Gradienten durch die Zugabe von Nigericin hebt den Transport auf, was mit dem H+-Cystin-Cotransport durch Cystinosin übereinstimmt. Der lysosomale Cystin-Transport hängt wiederum vom Vorhandensein von Adenosintriphosphat (ATP) ab, das die lysosomale H+-ATPase antreibt und den Cystin-Efflux antreibt (Abb. 14-7).46,68,69
Das Cystinosin-.GYDQL-Konstrukt wurde zur funktionellen Charakterisierung von krankheitsassoziierten Fehlmutationen in Cystinosin verwendet. Größtenteils korrelieren der Transport und die klinischen Phänotypen, wobei der Transport durch Mutationen, die mit nephropathischer Cystinose assoziiert sind, aufgehoben wird und die Restfunktion durch Konstrukte vermittelt wird, die Mutationen exprimieren, die mit juvenilen und okulären Subtypen der Krankheit assoziiert sind.66 Einige Mutationen, die mit der juvenilen Cystinose assoziiert sind, heben jedoch den Transport im Kontext von Cystinosin-.GYDQL auf, was darauf hindeutet, dass diese Mutationen geringere Auswirkungen auf das in lysosomalen Membranen exprimierte Cystinosin in voller Länge haben; eine Möglichkeit ist, dass Cystinosin mit lysosomalen Proteinen interagiert, die diese speziellen Mutantenformen stabilisieren.66 Auch der umgekehrte Fall tritt auf, so dass einige nephropathische Cystinose-Mutationen minimale Auswirkungen auf den durch Cystinosin-.GYDQL vermittelten Transport haben.66
Die gezielte Deletion von Cystinosin in Mäusen führt zu einer Anhäufung von Cystin in mehreren Organen, einschließlich der Niere.70 Fokale Ablagerungen von Cystinkristallen lassen sich in verschiedenen Geweben nachweisen, auch in proximalen Tubuluszellen. Diese Mäuse weisen jedoch keine proximale Tubulopathie auf, was darauf schließen lässt, dass die Anhäufung von Cystinkristallen allein nicht krankheitsverursachend ist.70 Die Augenanomalien bei Cystinosin-defizienten Mäusen ähneln jedoch sehr stark denen von Patienten mit Cystinose. So entwickeln diese Tiere Cystinkristallablagerungen auf der Hornhaut und depigmentierte Flecken auf der Netzhaut, was auf eine Retinopathie hinweist.70