Cheadle erhielt seine Screen Actors Guild (SAG)-Karte, als er 1985 als Angestellter eines Burgerladens in der Komödie Moving Violations auftrat. 1987 erhielt er eine kleine Rolle in Staffel 7, Folge 19 von Hill Street Blues, wo er einen Teenager mit Lernschwierigkeiten spielte. Noch im selben Jahr folgte ein Auftritt in Hamburger Hill; Cheadle sicherte sich die Rolle des Jack in der Episode „Jung and the Restless“ von Night Court am 1. April 1988. Obwohl seine Figur 16 Jahre alt war, war Cheadle zu diesem Zeitpunkt 23 Jahre alt.
Cheadle spielte dann die Rolle des Rocket in dem Film Colors von 1988. 1989 trat er in einem Video für Angela Winbushs Nr. 2-Hit „It’s the Real Thing“ auf, in dem er in einem orangefarbenen Overall tanzte und in einer Autowaschanlage arbeitete. 1990 trat er in einer Folge von The Fresh Prince of Bel-Air mit dem Titel „Homeboy, Sweet Homeboy“ auf und spielte Will Smiths Freund und Hilarys erste große Liebe Ice Tray. 1992 spielte er eine Nebenrolle in dem The Golden Girls-Spin-Off The Golden Palace. Anschließend spielte Cheadle den Bezirksstaatsanwalt John Littleton in drei Staffeln von Picket Fences.
Cheadle erlangte erstmals große Aufmerksamkeit für seine Darstellung von Mouse Alexander in dem Film Devil in a Blue Dress, für die er von der Los Angeles Film Critics Association und der National Society of Film Critics als Bester Nebendarsteller ausgezeichnet und für ähnliche Preise von der Screen Actors Guild und den NAACP Image Awards nominiert wurde. Kurz darauf folgte sein Auftritt in der Titelrolle des HBO-Fernsehfilms Rebound von 1996: Die Legende von Earl „The Goat“ Manigault. Außerdem spielte er 1997 die Hauptrolle in dem Film Volcano unter der Regie von Mick Jackson. Außerdem spielte er in Rush Hour 2 mit Jackie Chan und Chris Tucker.
Zu seinen Fernsehrollen gehören Emmy-nominierte Auftritte in den Filmen The Rat Pack, A Lesson Before Dying, Things Behind the Sun und ein Gastauftritt in ER. In der neunten Staffel der Serie spielte er in vier Episoden Paul Nathan, einen Medizinstudenten, der mit der Parkinson-Krankheit zu kämpfen hat. Er hatte Auftritte in Filmen wie Rosewood, The Family Man, Boogie Nights, Out of Sight, Traffic und Ocean’s Eleven. Bei den letzten drei Filmen führte Steven Soderbergh Regie. Er hatte einen Cameo-Auftritt in dem Film Abby Singer. Im Jahr 2005 wurde Cheadle für seine Darstellung des Paul Rusesabagina im Film Hotel Ruanda für den Oscar als bester Schauspieler nominiert. Außerdem spielte er die Hauptrolle in dem Film Crash, der 2006 mit dem Oscar für den besten Film ausgezeichnet wurde, und war dessen Co-Produzent. Für seine Leistung in Crash wurde Cheadle für den BAFTA und den Screen Actors Guild Award als bester Nebendarsteller nominiert. Er spielte die Hauptrolle in dem Film Traitor.
Im März 2007 spielte Cheadle zusammen mit dem Komiker Adam Sandler in Mike Binders Reign Over Me, einem Komödien-Drama über einen Mann, der nach dem Tod seiner Frau und seiner drei Töchter beim 11. September aus der Realität gerutscht ist. Der Film war mit einem Einspielergebnis von 22,2 Millionen Dollar ein Flop an den Kinokassen. Später spielte Cheadle die Hauptrolle in dem DreamWorks Pictures-Film Hotel for Dogs von 2009. Cheadle sollte sein Regiedebüt mit der Adaption von Elmore Leonards Tishomingo Blues geben, aber im Juli 2007 erklärte er: „‚Tishomingo‘ ist tot…“
Cheadle trat von 2002 bis 2005 in NFL-Werbespots für den Super Bowl auf. Er trat so regelmäßig in der Super-Bowl-Werbung der NFL auf, dass die NFL im Jahr 2006, als sie die Fans dazu bringen wollte, ihre eigenen Werbeideen einzureichen, ihn um Erlaubnis bat, auf seine früheren Werbespots Bezug zu nehmen, um zu zeigen, dass sie keine neuen Ideen hatte: „Er stimmte der Idee schnell zu und fand sie lustig“. Abe Sutton (zusammen mit Etan Bednarsh), einer der Finalisten in diesem NFL-Wettbewerb, spielte auf diesen Werbespot an, indem er einen Werbespot vorschlug, in dem jeder Spieler einer Football-Mannschaft Don Cheadle ist.
Im Jahr 2009 arbeiteten Cheadle und der Schöpfer der Boondocks, Aaron McGruder, an einer möglichen Comedy-Show auf NBC. Das „Projekt dreht sich um ungleiche Brüder, die sich wieder zusammenfinden, um eine private Sicherheitsfirma zu eröffnen.“ Cheadle und McGruder sollten als ausführende Produzenten fungieren, während McGruder das Drehbuch schreiben sollte.
Ebenfalls 2009 spielte Cheadle in The People Speak mit, einem Dokumentarfilm, in dem Briefe, Tagebücher und Reden alltäglicher Amerikaner dramatisch und musikalisch dargestellt werden, basierend auf dem Buch A People’s History of the United States des Historikers Howard Zinn.
Im Jahr 2010 übernahm Cheadle die Rolle von War Machine / James Rhodes in Iron Man 2 (2010) und ersetzte damit Terrence Howard. Cheadle wiederholte diese Rolle in Iron Man 3 (2013), Avengers: Age of Ultron (2015), Captain America: Civil War (2016), Avengers: Infinity War (2018), und Avengers: Endgame (2019), The Falcon and the Winter Soldier (2021) und er wird die Rolle in der kommenden Disney+ Serie Armor Wars wieder aufnehmen.
Von 2012 bis 2016 spielte Cheadle die Hauptrolle in der Showtime TV-Serie House of Lies. 2013 gewann er für seine Rolle in der Serie den Golden Globe als bester Schauspieler in einer Comedy-Serie.
Cheadle verbrachte zehn Jahre damit, den Film Miles Ahead (2016) zu schreiben und zu produzieren, der auf dem Leben des Jazzmusikers Miles Davis basiert. Cheadle führte auch Regie und spielte die Hauptrolle in dem Film. Die Drehorte für den Film wurden in Cincinnati gefunden.
Im Jahr 2018 hatte Cheadle einen Gastauftritt im Finale der ersten Staffel von DuckTales, wo er Donald Duck eine neue Stimme gab. Später, im Jahr 2020, hatte er einen weiteren Gastauftritt in Staffel 3, nachdem ein Wunsch von Donald an Gene, den Flaschengeist, die Realität verändert hatte.