Elisabeth heiratete 1559 Philipp II. von Spanien, den Sohn von Karl V., Kaiser des Heiligen Römischen Reiches, und Isabella von Portugal. Ursprünglich wurde sie vor ihrer Abreise aus Frankreich stellvertretend in Notre Dame getraut (der Herzog von Alba vertrat Philipp), doch die eigentliche Zeremonie fand nach ihrer Ankunft in Guadalajara, Spanien, statt. Die Ehe war das Ergebnis des Friedens von Cateau Cambrésis (1559). Seine zweite Frau, Maria I. von England, war kurz zuvor gestorben, so dass Elisabeth von Valois Philipps dritte Ehefrau wurde.
Bei ihrer Hochzeit lernte sie den Maler Sofonisba Anguissola und Ana de Mendoza kennen, mit der sie den Rest ihres Lebens zusammenleben sollte. Philipp II. ernannte Anguissola zur Hofdame und Hofmalerin seiner Königin. Unter Anguissolas Anleitung verbesserte Elisabeth ihre Fähigkeiten als Amateurmalerin. Anguissola beeinflusste auch das künstlerische Schaffen ihrer Kinder, Isabella Clara Eugenia und Caterina Michaela, während ihrer Zeit am Hof.
Philip war von seiner 14-jährigen Braut völlig verzaubert und hatte 1564 seine Untreue aufgegeben. Trotz des beträchtlichen Altersunterschieds war auch Elisabeth sehr zufrieden mit ihrem Mann (in Briefen an ihre Mutter erklärte sie, sie könne sich glücklich schätzen, einen so charmanten Prinzen geheiratet zu haben). Philipp veranstaltete gerne ritterliche Turniere, um seine Frau zu unterhalten. Elisabeth spielte die Lehnsherrin der drei jungen Prinzen des spanischen Hofes: Carlos, Prinz von Asturien, Johannes von Österreich (unehelicher Sohn Karls V.) und Alexander Farnese, Herzog von Parma (Sohn von Karls V. unehelicher Tochter Margarete).
Elisabeth war ursprünglich mit Philipps Sohn, Carlos, Prinz von Asturien, verlobt worden, aber politische Komplikationen machten unerwartet eine Heirat mit Philipp erforderlich. Ihr Verhältnis zu ihrem unruhigen Stiefsohn Carlos war warm und freundlich. Trotz Berichten über sein zunehmend bizarres Verhalten war Carlos immer freundlich und sanft zu Elisabeth. Als Philipp ihn schließlich wegsperren musste (was kurz darauf zum Tod des Prinzen führte), weinte Elisabeth tagelang.
Philip war Elisabeth sehr zugetan und blieb an ihrer Seite, selbst als sie an den Pocken erkrankte. Elisabeths erste Schwangerschaft im Jahr 1560 endete mit einer Totgeburt eines Sohnes, 1564 folgte eine Fehlgeburt von Zwillingsmädchen. Später, am 12. August 1566, gebar sie Infantin Isabella Clara Eugenia von Spanien und am 10. Oktober 1567 Isabellas jüngere Schwester Catherine Michelle von Spanien. Phillip und Elisabeth standen ihren beiden Töchtern sehr nahe und kauften ihnen Marmelade, Puppen, Spielzeug und vieles mehr. Es heißt, „beide freuten sich über die Geburt von Isabella, als ob es die Geburt eines Sohnes gewesen wäre“. Elisabeth hatte am 3. Oktober 1568 eine weitere Fehlgeburt und starb noch am selben Tag zusammen mit ihrer neugeborenen Tochter.
Nach dem Tod von Elisabeth bot Katharina von Medici ihre jüngere Tochter Margaret als Braut für Philipp an. Philipp lehnte das Angebot ab.