Frontiers in Plant Science

Einführung

Reis hat eine komplexe Wurzelarchitektur mit einer Mischung aus embryonalen und post-embryonalen Wurzeln. Während der Keimung bildet sich zuerst die Keimwurzel aus, kurz darauf folgen die embryonalen Kernwurzeln (Rebouillat et al., 2009; Coudert et al., 2010). Die ersten postembryonalen Adventivwurzeln, die aus der Aktivität des Sprossapikalmeristems hervorgehen, erscheinen einige Tage nach der Keimung des Sämlings. Adventivwurzeln werden auch als Koronar- oder Kronenwurzeln bezeichnet und werden während des gesamten Lebens einer Pflanze gebildet.

Die innere Anatomie der Reiswurzel ist gut beschrieben, insbesondere im Keimlingsstadium (Rebouillat et al., 2009). Mehrere konzentrische Gewebe (von der Peripherie bis zur Stele) befinden sich zwischen der Epidermis und den Gefäßgeweben (Abbildung 1). Diese Gewebe, die zusammen als „Grundgewebe“ bezeichnet werden, werden manchmal auch als „Kortex“ bezeichnet (Lux et al., 2004). Wir behalten hier den Oberbegriff „Grundgewebe“ bei, um die exodermalen, sklerenchymalen, kortikalen und endodermalen Gewebe zu beschreiben. Als „Kortex“ bezeichnen wir das Gewebe, das sich zwischen der Endodermis und dem Sklerenchym befindet.

Das Grundgewebe besteht aus mehreren Gewebeschichten, die denselben parenchymatösen Ursprung, aber unterschiedliche spezifische Eigenschaften haben, die verschiedene und wichtige strukturelle und funktionelle Rollen in den Wurzeln spielen. Exodermis und Endodermis sind beispielsweise apoplastische Barrieren, die den radialen Transport von Wasser und Nährstoffen aus dem Boden zu den photosynthetischen Organen kontrollieren, was hauptsächlich durch die Ablagerung von Suberinlamellen und die sekundäre Zellwanddifferenzierung geschieht (Gregory, 2006). Sklerenchymzellen sind verholzte Zellen, die eine kritische Barriere für einige Metalle darstellen und möglicherweise eine mechanische Stützfunktion haben (Huang et al., 2012). Im Gegensatz zu diesen drei einschichtigen Geweben besteht das Rindengewebe in der Reiswurzel aus vier oder fünf Schichten. Dieses Gewebe, das auch als Mittelkortex oder Mesodermis bezeichnet wird, zeichnet sich durch die schizogene Bildung von Zwischenräumen aus, die zur Bildung des Aerenchyms im Reis führen (Justin und Armstrong, 1991; Kawai et al., 1998). Das Aerenchym spielt eine wichtige Rolle bei der Toleranz gegenüber Überschwemmungen und gewährleistet einen kontinuierlichen Sauerstofffluss vom Spross zur Wurzel, was das Wurzelwachstum unter anoxischen Bedingungen ermöglicht. Die Rinde hat eine wichtige, aber variable Funktion in der Wurzelphysiologie zahlreicher Arten und ist an der Speicherung, der Überflutungstoleranz oder symbiotischen Interaktionen beteiligt (Lux et al., 2004).

Die Wurzel- und Kronenwurzeln produzieren drei Arten von Seitenwurzeln: kleine Seitenwurzeln (SLRs) und zwei Arten von großen Seitenwurzeln (Kawata und Shibayama, 1965; Kono et al., 1972; Rebouillat et al., 2009). Diese Einteilung basiert auf (i) dem Wurzeldurchmesser: SLRs sind die kleinsten (50-60 μm) und L-LLRs die größten (120-150 μm), (ii) Verzweigungen, die nur an LLRs beobachtet werden, (iii) das Vorhandensein eines zentralen Metaxylemgefäßes nur in LLRs und (iv) das Vorhandensein einer Sklerenchymschicht nur in L-LLRs (Kono et al., 1972; Kawata et al., 1977; Rebouillat et al., 2009). Trotz dieser Klassifizierung bleibt die Identität der inneren Wurzelgewebe in Seitenwurzeln, insbesondere in SLR, ungewiss. Rebouillat et al. (2009) und Kawata et al. (1977) behaupteten beide, dass das Grundgewebe der SLR aus Endodermis, Sklerenchym und Exodermis (von innen nach außen) besteht, während Kono et al. (1972) beschrieben, dass die Sklerenchymzellschicht der inneren Rinde in SLRs und T-LLRs nicht vorhanden ist.

Um dieses Dilemma zu lösen und die Entwicklung und Funktion bestimmter Gewebe im Allgemeinen zu untersuchen, ist die Verwendung von Identitätsmarkern erforderlich. Die meisten der bisher verwendeten Gewebemarker sind morphologische Marker oder histochemische Färbungen, die eine nützliche Methode zur Charakterisierung der Zellidentität darstellen. Berberin zeigt das Vorhandensein von Suberin in den Zellwänden an, das fast ausschließlich in den Caspar’schen Streifen zu finden ist, die jede einzelne Endodermiszelle umgeben, und ist somit ein guter indirekter Marker für die endodermale Identität (Brundett et al., 1988). In A. thaliana wurden auch gewebespezifische Marker entwickelt, indem gewebespezifische Promotoren mit Reportergenen (GUS und/oder GFP) in gentechnisch veränderten Pflanzen fusioniert wurden. So wird beispielsweise der SCARECROW-Promotor als endodermaler Identitätsmarker verwendet (Sugimoto et al., 2010). QC25 und QC46 Enhancer Trap GUS-Linien (Sabatini et al., 2003) und QHB in Reis (Kamiya et al., 2003) wurden aufgrund ihrer QC-spezifischen Expression ebenfalls als Marker für das Ruhezentrum (QC) identifiziert. Trotz des Interesses an diesen Markern sind nur wenige verfügbar und fast ausschließlich in A. thaliana. Sie haben auch Nachteile. So ist beispielsweise die Eignung des SCARECROW (SCR)-Promotors als „Endodermis“-Marker fraglich, wenn es um spezifische Fragen zur Rolle von SCR und SHORT ROOT (SHR) bei der Differenzierung von Grundgewebe geht. In der Tat sind die SCR- und SHR-Gene per se an der Endodermis-/Kortexbildung beteiligt (Wu und Gallagher, 2014). In A. thaliana sind die einzigen verfügbaren Wurzelrindenmarker die Co2 und Co3 Promotoren (Heidstra et al., 2004; Ten Hove et al., 2010). In Reis werden diese Rindenmarker noch nicht verwendet, da es keine eindeutigen Orthologe für die Gene Co2 und Co3 gibt. Bisher wurden bei Reis nur indirekte morphologische Marker verwendet, wie z. B. die Aerenchymbildung für die Rindenidentität (Rebouillat et al., 2009).

Eine weitere Klasse von Markern sind kommerziell erhältliche Antikörper, die gegen Pflanzenzellwände gerichtet sind (http://www.plantprobes.net/index.php). Diese Marker wurden in der Vergangenheit kaum verwendet, aber ihre Effizienz wurde nachgewiesen. So wurden beispielsweise die Zellwand-Antikörper CCRC-M2 und JIM13 bei A. thaliana verwendet, um zu zeigen, dass die einzige Schicht des inneren Gewebes der shr-Mutante eine kortikale Identität aufweist, während die Schicht des Grundgewebes der scr-Mutante mehrere Identitäten aufweist (Di Laurenzio et al., 1996; Helariutta et al., 2000). Diese Marker haben viele Vorteile: ihre Einfachheit und die Möglichkeit, sekundäre Antikörper zu kombinieren, die an verschiedene Fluorochrome gekoppelt sind, um Überschneidungen mit der Autofluoreszenz zu begrenzen, sie erfordern keine genetische Transformation und sie können zur Ergänzung anderer Markerklassen verwendet werden.

In dieser Arbeit beschreiben wir zunächst ein einfaches Protokoll mit mittlerem Durchsatz für die Immunmarkierung frischer Vibratom-Gewebeschnitte. Mit Hilfe dieses Protokolls haben wir Radialschnitte von Reiswurzeln mit einer großen Bibliothek von 174 Zellwand-Antikörpern untersucht. Unter diesen identifizierten wir acht rindenspezifische Marker und wiesen nach, dass Reis zwei Arten von Rindengeweben mit unterschiedlicher Identität besitzt. Wir nannten diese Schichten die innere und die äußere Rinde, basierend auf ihrer jeweiligen anatomischen Position in den Wurzelabschnitten. Um die Nützlichkeit dieser rindenspezifischen Marker zu demonstrieren, haben wir die Identität des Grundgewebes von Seitenwurzeln mit drei dieser Antikörper geklärt. Insbesondere bei SLRs zeigen wir, dass die innere Gewebeschicht eine äußere kortikale Identität aufweist. Unser Protokoll ist so allgemein gehalten, dass es für die Entwicklung von Gewebemarkern bei jeder Art verwendet werden kann, ohne dass transgene Pflanzen erzeugt werden müssen. Dieses Protokoll kann leicht an frische Spross-, Blatt-, Wurzel- oder beliebige andere Pflanzengewebe angepasst werden und stellt eine einfache und leichte Methode zur Identifizierung gewebespezifischer Marker dar. Darüber hinaus können diese Marker in Verbindung mit anderen molekularen Markern verwendet werden.

Ergebnisse

Immunoprofiling von Zellwand-Antikörpern in Radialschnitten von Reiswurzeln zeigt spezifische Antikörper für Rindenschichten

Mit dem Ziel, Antikörper-basierte Marker für Rindenzellen zu identifizieren, haben wir zunächst ein Protokoll für die Immunolabeling von Radialschnitten frischer Reiswurzeln mit mittlerem Durchsatz erstellt (siehe Material und Methoden und ergänzende Abbildung 1 für Details). Anschließend führten wir ein Screening mit monoklonalen Antikörpern durch, die gegen Zellwandbestandteile gerichtet waren (vom Complex Carbohydrate Research Center (CarboSource Services, Athens Georgia, USA) und vom Paul Knox Cell Wall Lab (Universität Leeds, UK), siehe Materialien und Methoden für weitere Einzelheiten), um Kortexmarker zu identifizieren. Von den 174 getesteten Antikörpern wurden nur 12 als vermeintlich kortexspezifisch ausgewählt. Wir testeten ihre Wiederholbarkeit durch zwei zusätzliche Experimente und kamen zu dem Schluss, dass acht Antikörper in den drei Wiederholungen ähnliche und stabile Profile aufwiesen (Abbildung 2). Fünf Antikörper (JIM7, M14, M38, M130 und M131) zeigten in der Rinde das gleiche Immunmarkierungsmuster. Nur nicht benachbarte Zellwände wurden markiert, was zu einer einzigartigen „rautenförmigen“ Markierung aller kortikalen Zellen führte. Bei den drei anderen Antikörpern (LM5, M133 und M107) wurde die Markierung in der Rinde und manchmal in den Sklerenchymzellen nachgewiesen, insbesondere mit den Antikörpern LM5 und M107. Das Signal war homogen auf der Zellwand der Rinde, aber in den inneren Rindenschichten (der an die endodermale Schicht angrenzenden Rindenschicht) war es viel schwächer als in den äußeren Rindenschichten. Somit sind alle diese Antikörper mit Profilen, die komplementär zu kortikalen Geweben sind, spezifische Marker, die zur Analyse der kortikalen Zellidentität verwendet werden können. Darüber hinaus deuten die zwei unterschiedlichen kortikalen Markierungen, die zwei subkortikale Bereiche definieren, darauf hin, dass die äußeren und inneren Schichten eine unterschiedliche molekulare Identität haben, die durch diese Antikörper aufgedeckt wurde.

Einige spezifische Merkmale dieser beiden subkortikalen Schichten wurden hervorgehoben, als das „Polartransformator“-Plugin der ImageJ-Software (http://imagej.nih.gov/ij/) verwendet wurde, um die Bilder der Wurzelschnitte zu betrachten (Abbildungen 1B,C; Schneider et al., 2012; Lartaud et al., 2014). Die inneren Zellen zeichneten sich durch eine dicke Zellwand im Vergleich zu den äußeren Zellen aus, die verschiedene luftenthaltende Hohlräume aufwiesen, die aus der Zellwandfusion resultierten. Die inneren Rindenzellen wiesen auch eine abgeflachte Form auf, die endodermalen Zellen ähnelte, im Gegensatz zu den äußeren Zellen, die runder waren. In diesem transformierten Bild ist die radiale Zellwand, die von der Innenseite der Zelle zur Außenseite verläuft, und die Autofluoreszenz der endodermalen und exodermalen Zellen nicht sichtbar, was vermutlich auf das Vorhandensein von Casparschen Streifen zurückzuführen ist. In ähnlicher Weise, aber in geringerem Maße, waren kleine Löcher ohne Autofluoreszenz auch an den radialen Zellwänden der inneren Rindenzellen sichtbar.

Alle Seitenwurzeltypen besitzen nur äußeres Rindengewebe

Um die Nützlichkeit der Rindenmarker zu demonstrieren und die Zellidentitäten zu charakterisieren, markierten wir die drei Reis-Seitenwurzeltypen (L-LLR, T-LLR und SLR) mit drei dieser Antikörper (M107, M133 und M14). Da sich L-LLRs nicht oft auf Petrischalen entwickeln, wurden für dieses Experiment Seitenwurzeln von Reissetzlingen gesammelt, die 2 Wochen lang unter hydroponischen Bedingungen gewachsen waren. Zunächst analysierten wir die Organisation des Grundgewebes jedes Typs von Seitenwurzeln, indem wir die Autofluoreszenz der Zellwände in den Quer- und Polaransichten der Wurzelschnitte beobachteten (Abbildung 3). Diese erste Analyse ergab eine leicht unterschiedliche innere radiale Anatomie für die drei Typen von Seitenwurzeln. Ähnlich wie bei den unter UV-Licht betrachteten Wurzelschnitten lassen sich die endodermalen und exodermalen Gewebe durch die Fluoreszenzauslöschung in der Mitte der radialen Zellwände erkennen. Diese beiden Gewebe waren in allen Seitenwurzeln vorhanden. Zwischen der Endodermis und der Exodermis befanden sich in den L-LLRs und T-LLRs mehrere Gewebeschichten, während die SLRs nur eine einzige (nicht identifizierte) Zellschicht besaßen. Die Anatomie der L-LLRs sah aus wie eine Samenwurzel, und außerhalb der Endodermis waren bei der Bildung von Aerenchymgewebe leicht mehrere Schichten von Rindengewebe zu erkennen. Darüber hinaus wurde auch eine Sklerenchymschicht aus dicht gepackten Zellen mit breiten Zellwänden beobachtet. Je nach Experiment war diese Zellschicht nicht immer vollständig ausgebildet. In den T-LLR-Schnitten ähnelte die äußere Schicht dem Kortikalisgewebe und die innere Schicht der einzelnen (nicht identifizierten) SLR-Schicht.

Um die im SLR- und T-LLR-Grundgewebe vorhandenen Zellschichten zu identifizieren und die kortikale Identität in den L-LLRs zu bestätigen, haben wir laterale Wurzelschnitte mit drei kortikalspezifischen Antikörpern (M107, M133 und M14; Abbildung 4) immungefärbt. Die Antikörper M107 und M133 markierten alle Zellschichten zwischen der Endodermis und der Exodermis in allen Seitenwurzeln. Ausgehend von der Färbung der Radicula mit diesen Antikörpern deutet diese Beobachtung darauf hin, dass diese Zellschichten eine Sklerenchym- oder Kortikalidentität aufweisen könnten. Die Tatsache, dass M14 auch diese Schichten immunmarkierte, insbesondere in den SLR-Abschnitten, zeigt jedoch eindeutig, dass diese Schichten eine äußere kortikale Identität hatten.

Variationen in der Anzahl der äußeren Rindenzellschichten (eine in den SLRs, zwei in den T-LLRs, drei in den L-LLRs und vier bis fünf in der Keimwurzel) spielen eine wichtige Rolle für den Durchmesser der Reiswurzel (Abbildung 5).

Schlussfolgerungen

Es wurden bereits verschiedene Begriffe verwendet, um subkortikale Bereiche in Pflanzen zu bezeichnen. Zum Beispiel wurde das Vorhandensein einer „inneren“ verholzten Rindenschicht, vergleichbar mit der hier untersuchten, bereits bei Wildreis beschrieben (Yang et al., 2014). Bei Mais sind die beiden kortikalen Domänen unterschiedlich definiert (Baluška et al., 1993). Die „innere“ Domäne bildet Aerenchym, was hier der äußeren Rinde entspricht, und die „mittlere-äußere“ Rinde ist ein verholztes Stützgewebe, das Sklerenchym sein könnte. Bei Arabidopsis wurde ebenfalls eine „mittlere Kortex“-Zellschicht beschrieben, die zwischen der kortikalen Monolage und der Endodermis liegt (Baum et al., 2002; Paquette und Benfey, 2005). Neuere Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Rindenschicht, deren Bildung unter anderem durch GA, oxidativen Stress sowie SHR und SCR reguliert wird, eine Rolle bei der abiotischen Toleranz spielt (Paquette und Benfey, 2005; Cui und Benfey, 2009; Pauluzzi et al., 2012; Wu und Gallagher, 2014). Interessanterweise wird diese Schicht auch als eine helixartige Schicht mit einer typischen Form beschrieben (Baum et al., 2002). Könnte diese „mittlere Rindenschicht“ von Arabidopsis funktionell und strukturell der inneren Rindenschicht der Reiswurzel ähnlich sein? In Längs- und Querschnitten von Reis bildet die innere Rindenschicht in der Regel ebenfalls eine Helix, was darauf schließen lässt, dass diese beiden Gewebeschichten vergleichbar sein könnten. Bei Arabidopsis stammt die „mittlere Rindenschicht“ von einer periklinalen Endodermis-Teilung ab, die zwischen 7 und 14 Tagen nach der Keimung vom QC entfernt erscheint (Paquette und Benfey, 2005). Um diese wichtigen Parameter bei Reis zu überprüfen, werden neue Instrumente erforderlich sein. So wurde beispielsweise bisher keine Mutante beschrieben, die den Zeitpunkt der Bildung dieser Schicht beeinflusst. Darüber hinaus sind auch technische Fortschritte bei der Bildgebung des Reis-QC erforderlich. Nichtsdestotrotz bieten unsere Kortex-spezifischen Marker ein neues Werkzeug, um die Funktion und das molekulare Netzwerk zu vergleichen, das an der Bildung des inneren Kortex (Reis) im Vergleich zum „mittleren Kortex“ (Arabidopsis) beteiligt ist. In unserem Labor wird derzeit an der Identifizierung der molekularen Determinanten der inneren und äußeren Rindenbildung gearbeitet, wobei SCR- und SHR-Reisorthologe als erste Kandidaten für die Regulierung der Rindenbildung in Reiswurzeln gelten (Pauluzzi et al, 2012).

Materialien und Methoden

Pflanzenmaterial

Sechs-Tage-alte Sämlinge

Samen der Oryza sativa L. ssp. japonica Nipponbare cultivar wurden vertikal in sterilen Petrischalen (Corning, 431301; 20 × 20 cm) unter kontrollierten Bedingungen (Tag/Nacht-Rhythmus: 12/12 h, 28/25°C, Lichtintensität: 500 μE m-2 s-1) angezogen. Zunächst wurden die Samen durch Spülen in 70%igem Ethanol für ~1 Minute oberflächensterilisiert. Dann wurde das Ethanol durch eine Lösung aus 40 % Bleichmittel in destilliertem Wasser mit drei Tropfen Tween 80 (Sigma-Aldrich P4780-500 mL) ersetzt. Die Samen wurden 30 Minuten lang unter leichtem Rühren in dieser Lösung eingeweicht und anschließend mindestens viermal mit sterilem destilliertem Wasser gespült. Heißes (~50°C) autoklaviertes, halbstarkes Murashige- und Skoog-Medium (MS/2) (250 mL) wird in Petrischalen gegossen und für ~45 Minuten fest werden gelassen. Das MS/2-Festmedium besteht aus 2,15 g.L-1 MS-Medium Basalsalzmischung (Duchefa Biochemie, M0221), 75 mg.L-1 MS-Vitaminmischung (Duchefa Biochemie, M0409) und 8 g.L-1 Agarose Typ II (Sigma-Aldrich, A6877). Die sterilen Samen werden dann mit der Keimwurzel nach unten in das verfestigte MS/2-Medium gedrückt. Die Wurzeln wurden nach 6 Tagen Wachstum geerntet.

Vier Wochen alte Pflanzen

Nach 3 Tagen Keimung in Wasser wurden die Sämlinge in ein hydroponisches System unter kontrollierten Bedingungen (Tag/Nacht-Rhythmus: 12/12 h, 28/25°C, Lichtintensität: 500 μE m-2 s-1, relative Luftfeuchtigkeit: 55%) überführt. Das hydroponische System besteht aus einem 50-Liter-Kunststoffkasten, der 30 Liter hydroponische Lösung enthält und auf den eine 1 cm dicke Schaumstoffmatratze gelegt wird. Die Schaumstoffmatratze ist mit Löchern versehen, um die Triebspitzen der Sämlinge zu erhalten. Das Hydrokulturmedium besteht aus (NH4)2SO4 (0,5 mM), MgSO4.7H2O (1,6 mM), Ca(NO3)2.4H2O (1,2 mM), KNO3 (0,7 mM), FeSO4 (0,1 mM), Na2EDTA (0,1 mM), MnSO4. H2O (1,7 μM), (NH4)6Mo7O24.4H2O (0,2 μM), ZnSO4.7H2O (0,2 μM), CuSO4.5H2O (0,2 μM), H3BO3 (1,4 μM) und KH2PO4 (0,6 mM). Die Lösung wird durch eine Pumpe am Boden der Kunststoffbox belüftet und alle 10 Tage ausgetauscht. Der pH-Wert wurde auf 5,4 ± 0,2 eingestellt und gehalten.

Fresh Root Sectioning

Die Spitzen wachsender Radicula oder Seitenwurzeln (2 cm) wurden mit einer scharfen Klinge abgeschnitten und parallel zueinander platziert, um die Wurzelspitzen auszurichten (ergänzende Abbildungen 1A,B). Sie wurden in einen Tropfen 3%iger geschmolzener Agarose (50°C; ergänzende Abbildung 1C) eingebettet. Die Blöcke mit den Wurzelspitzen wurden in eine 3 × 1 × 1 cm große Vertiefung eingelegt, die mit 3 % geschmolzener Agarose gefüllt war (ergänzende Abbildung 1D). Nach dem Erstarren wurden die Blöcke in der Größe verändert und auf eine Vibratomplatte geklebt, um sie zu schneiden. Die Parameter des Vibratoms (Hm650v (Thermo Scientific Microm)) waren Geschwindigkeit 30, Frequenz 70, Amplitude 0,8 und Dicke 60 μm (ergänzende Abbildung 1E). Die Schnitte wurden entweder auf Kammer-Objektträger (Lab-teak 177402) für die Immunfärbung (ergänzende Abbildung 1F) oder auf mit 1X alkalischem Phosphatpuffer (PBS, Sigma-Aldrich P3813) befeuchtete Objektträger für die Beobachtung übertragen.

Immunolokalisierung

Die auf den Kammer-Objektträgern platzierten Schnitte (drei pro Kammer) wurden zunächst in 0,1 M Glycin, ergänzt mit 1X PBS, und dann zweimal in 1X PBS, jeweils für 10 min, gespült. Die Gewebe wurden dann in eine PBS-Lösung mit 5 % fötalem Rinderserum (Blocking Solution, Thermo Fisher 37520) bei 4 °C über Nacht unter Rühren getaucht. Primäre Antikörper, 1/10 in dieser Blockierungslösung verdünnt, wurden über Nacht bei 4 °C unter Rühren aufgetragen. Die Schnitte wurden dann dreimal 10 Minuten lang in 1facher PBS gespült. Die Wurzelschnitte wurden 2 Stunden lang mit den 500-fach in Blockierlösung verdünnten sekundären Antikörpern unter Rühren inkubiert. Diese Antikörper waren an einen Fluorophor, Alexa 546 Anti-Ratten-Antikörper (Invitrogen A11081) oder Alexa 546 Anti-Maus-Antikörper (Invitrogen A11060), gekoppelt. Anschließend wurden die Schnitte dreimal in 1X PBS unter Schütteln für jeweils 10 Minuten gespült. Die Kammern wurden entfernt und einige Tropfen Mowiol-Einbettungsmedium (Sigma-Aldrich 81381) wurden hinzugefügt. Die Wurzelabschnitte wurden mit einem Deckglas versehen und 36 Stunden lang bei 4°C im Dunkeln getrocknet.

Paraplast-Fixierung

Die 6 Tage lang auf Petrischalen gewachsenen Radicula wurden über Nacht bei 4°C in 4% Paraformaldehyd (in PBS 1X) fixiert und zweimal mit PBS 1X gespült (Jackson, 1991). Die fixierten Gewebe wurden in Ethanol dehydriert, mit Histochoice Clearing Agent (HistoClear, Sigma Aldrich) geklärt und in Paraplast (Fisher) eingebettet. Die Gewebe wurden mit einem Leica RM2255 Mikrotom in 6 μm dicke Schnitte geschnitten und auf SuperfrostPlus-Objektträger (Fisher) aufgezogen.

Mikroskopie

Aufhellungs- und Autofluoreszenzbeobachtungen wurden mit einem Leica DM4500 Mikroskop durchgeführt. Für die Autofluoreszenz wurden die Bilder mit dem „A“-Filterwürfel (Anregungsbereich: UV; Anregungsfilter: BP 340-380; Unterdrückungsfilter: LP 425). Die immungefärbten Schnitte wurden mit konfokalen Mikroskopen betrachtet: Zeiss LSM 510 oder Leica SP8. Die Zellwände wurden zunächst durch Autofluoreszenz sichtbar gemacht. Der sekundäre Antikörper wurde mit einem Helium/Neon-Laser bei 543 bzw. 561 nm sichtbar gemacht. Die Bilder wurden mit einer Farbkamera Retiga 2000R (QIMAGING, Kanada) aufgenommen, auf der die Bildaufnahmesoftware Volocity (Improvision, UK) läuft.

Beiträge der Autoren

SH, FD, MB, CB: Erfassung der Daten; SH, CP, AD: Analyse der Daten; SH, EG, CP, AD: Abfassung des Manuskripts.

Erklärung zu Interessenkonflikten

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit jeglicher kommerzieller oder finanzieller Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagungen

Wir danken MRI (Montpellier RIO Imaging plateform), PHIV und La Gaillarde Plateforms für ihre technische Unterstützung bei der Immunolokalisierung und/oder konfokalen und Multiphotonen-Bildgebung. SH wird durch ein CIRAD-Promotionsstipendium unterstützt.

Ergänzendes Material

Das ergänzende Material zu diesem Artikel finden Sie online unter: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2015.01139

Abkürzungen

ae, Aerenchym; c, Cortex; ed, Endodermis; ep, Epidermis; ex, Exodermis; gt, Grundgewebe; ic, innerer Cortex; L-LLR, Große Seitenwurzel vom Großtyp; oc, äußere Rinde; sc, Sklerenchym; SLR, Kleine Seitenwurzel; st, Stele; T-LLR, Große Seitenwurzel vom Dünntyp; x, Xylem.