Labornachweis und Identifizierung von Aspergillus-Spezies durch mikroskopische Beobachtung und Kultur: der traditionelle Ansatz

Abstract

Molekulare und immunologische Tests versprechen eine bessere und schnellere Labordiagnose der Aspergillose, aber Mikroskopie und Kultur bleiben allgemein verwendete und wesentliche Instrumente. Verfahrensänderungen sowie eine angemessene Schulung der Labormitarbeiter können den Wert dieser traditionellen Instrumente erhöhen. Die Verwendung von Blankophor oder Calcofluor für mikroskopische Untersuchungen, die Verbesserung der Erkennung von morphologischen Merkmalen opportunistischer Pilze in gefärbten Probenausstrichen, die Maximierung der Wachstumsrate und der Konidienproduktion von Aspergillus spp. in der Kultur und die Erkennung atypischer Varianten häufiger Aspergillen können den Beitrag des Labors zur schnellen Diagnose verbessern. Erhebungen zeigen, dass die Zahl der Laborfachkräfte abnimmt, während die Nachfrage nach Gesundheitsleistungen steigt. Eine effektive Rekrutierung, Bindung und Schulung des Personals muss mit den Fortschritten in der Technologie einhergehen.

Einführung

Traditionelle Methoden zur Diagnose von Aspergillose und anderen Mykosen werden durch molekulare und immunologische Ansätze ergänzt. Obwohl die Vorteile von Tests auf Nukleinsäurebasis auf der Hand liegen, sind ihre Standardisierung und ihr klinischer Nutzen noch nicht vollständig verwirklicht. Während der Galactomannan-EIA-Test für Aspergillus-Antigen in den USA weit verbreitet ist, werden Nukleinsäure-basierte Tests für die Identifizierung klinischer Isolate offenbar nur begrenzt eingesetzt. Zu den Referenzlabors, die eine molekulare Identifizierung von Aspergillen anbieten, gehören die Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Atlanta, Georgia, das Centraalbureau voor Schimmelcultur (CBS), Utrecht, Niederlande, sowie Labors in den USA, die im Online-Testverzeichnis der Association for Molecular Pathology aufgeführt sind. Obwohl die molekularen Methoden immer besser und leichter verfügbar werden, sind Mikroskopie und Kultur nach wie vor die wichtigsten Laborinstrumente zum Nachweis von Aspergillen. Die Benchmarking-Umfrage der American Society for Microbiology (ASM) aus dem Jahr 2003 dokumentiert, dass 89 % der Labors, die mykologische Tests durchführen, Kulturen verwenden, 16 % Serologie und weniger als 5 % molekulare Tests. Nur 3 % der meldenden Laboratorien verwenden selbstgebastelte“ molekulare Tests für mikrobielle Krankheitserreger. Angesichts der anhaltenden Abhängigkeit von Mikroskopie und Kultur muss der diagnostische Wert dieser Methoden durch Verfahrensänderungen und eine angemessene Schulung des Laborpersonals verbessert werden.

Mikroskopie

Mikroskopische Methoden wie Nasspräparate, Gram-Färbungen und konventionelle Histopathologie liefern Hinweise auf das Vorhandensein von Aspergillus spp. im Gewebe. Blankophor oder Calcofluor, gemischt mit 10-20 % Kaliumhydroxid (KOH), färbt die Zellwände von Pilzen und verbessert den Nachweis von Pilzen. Während Calcofluor bei einem alkalischen pH-Wert kristallisiert, kristallisiert Blankophor nicht und kann in einer Arbeitslösung bis zu einem Jahr gelagert werden. Phänotypische Marker, die durch histopathologische Färbungen sowie durch Gram-Färbungen oder Nasspräparate nachgewiesen werden, liefern wertvolle Informationen über klinisch wichtige Pilze, insbesondere wenn keine Kultur angelegt wurde (Tabelle 1). Eine Bestätigung der mikroskopischen Befunde durch Kultur ist jedoch immer wünschenswert und in den meisten Fällen, in denen es sich um opportunistische Schimmelpilze handelt, für die endgültige Identifizierung des Erregers unerlässlich. Trotz des Vorhandenseins visueller Anhaltspunkte kann die Identifizierung von Aspergillen durch Mikroskopie allein irreführend sein. Schell berichtet über einen Fall von Aspergillus niger Sinusitis, bei dem die Konidien von A. niger mit den Hefezellen von Candida spp. verwechselt wurden und Querschnitte der Stipes von A. niger mit den breiten Hyphen eines Zygomyceten. Die Kommunikation zwischen dem klinischen Pathologen und dem Labormykologen, der routinemäßig filamentöse Pilze anhand von Kulturen identifiziert, kann den diagnostischen Wert der Histopathologie verbessern.

Erkennung morphologischer Merkmale

Da Aspergillen in der Natur allgegenwärtig sind, können sie häufig Proben und Kulturmedien kontaminieren. Daher ist die Bestimmung der Bedeutung von Aspergillus spp., die in Kulturen wachsen, oft eine Herausforderung, wenn die mikroskopische Untersuchung der Probe negativ ist. In einer Untersuchung von Aspergillus-Isolaten von Leber- und Nierentransplantatempfängern stellten Brown et al. fest, dass das Vorhandensein von mehr als zwei Kolonien in einer Kultur und eine Infektion an mehr als einer Stelle eine signifikante Infektion voraussagt. Bei granulozytopenischen Patienten mit akuter Leukämie muss eine einzige Isolierung aus einer Probe der unteren Atemwege als signifikant angesehen werden. Unmissverständliche Berichte über Laborbeobachtungen an den Arzt können das diagnostische Dilemma verringern. So liefert beispielsweise die Aussage „Insgesamt drei Kolonien von Aspergillus fumigatus auf zwei von drei Platten isoliert“ mehr Informationen als „Seltener A. fumigatus isoliert“.

Optimierung der Kulturergebnisse

Die Isolierung in Kultur und die phänotypische Identifizierung häufiger klinischer Isolate von Aspergillus spp. ist normalerweise schnell und einfach. Die Kultur wird jedoch oft als langsam beschrieben, was vielleicht zu falschen Vorstellungen über ihren Wert für den Nachweis von Aspergillen führt. A. fumigatus ist ein Schnellzüchter. Die typischen velutinösen, graublau-grünen Kolonien und die uniseraten Konidienköpfe entwickeln sich innerhalb von 24-48 Stunden sowohl auf Pilzmedien als auch auf dem üblicherweise für Bakterienkulturen verwendeten Schafsblutagar. Andere Aspergillen, die mit invasiver Aspergillose in Verbindung gebracht werden, insbesondere A. flavus, A. niger, A. nidulans und A. terreus, haben ähnliche Wachstumsraten wie A. fumigatus, wenn die Kolonien auf Malzextrakt-Agar und Czapek-Hefe-Agar nach siebentägiger Bebrütung bei 25°C und 37°C gemessen wurden. Da die Medikamentenresistenz einiger Aspergillus spp. eine Bedrohung darstellt, ist eine vollständige Identifizierung nicht nur von A. fumigatus, sondern auch der weniger häufig isolierten Arten gewährleistet. Laborwissenschaftler müssen auch atypische Isolate von Aspergillus spp. erkennen. Kürzlich wurde über schlecht sporulierende (weiße) Stämme von A. fumigatus mit verminderter Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Antimykotika berichtet. Diese weißen Stämme haben eine genetische Sequenz, die sich von der des Wildtyps A. fumigatus Fresenius unterscheidet, und entwickelten erst 10-12 Tage nach der Inkubation die typischen blaugrünen Konidienköpfe. Eine weitere Herausforderung ist der weiße Schimmelpilz Neosartorya fisheri, der zunächst spärliche Konidienköpfe produziert, die denen von A. fumigatus ähneln. Allerdings entwickelt N. fisheri später zahlreiche runde, dünnwandige Cleistothecien, was die Unterscheidung von A. fumigatus einfach macht. Ein Präpariergerät ist praktisch, um Konidienköpfe und Cleistothecien schnell zu lokalisieren. Es können sterile, weiße, schnell wachsende oder kahle, hügelige, langsam wachsende Isolate von A. fumigatus auftreten, die zur endgültigen Identifizierung einen Thermotoleranz- und Exoantigentest erfordern. Khan et al. berichteten über einen atypischen A. terreus, isoliert aus Proben der unteren Atemwege eines Patienten mit Aspergillom. Die Anfangskolonien waren orange und produzierten ein diffusionsfähiges gelbes Pigment und kleine, einzelne Zellen, die mit den Konidien von Scedosporium apiospermum verwechselt wurden. Ausfällende Antikörper und typische Konidienköpfe von A. terreus, die nach zehnwöchiger Inkubation gebildet wurden, bestätigten die Identifizierung.

Die in Lehrbüchern und im Internet verfügbaren Bilder und Informationen bieten gute Lehrmöglichkeiten, um die Identifizierung von Aspergillus spp. zu erlernen. Die praktische Erfahrung bleibt jedoch das wirksamste Lehrmittel. Die CDC, das National Laboratory Training Network (NLTN) und die CBS bieten Laborworkshops an. Wenn eine Reise ins Ausland nicht praktikabel ist, wird den Labors empfohlen, das Online-Tutorial Aspergillus Reference Cultures (Aspergillus-Referenzkulturen) für interne Schulungen zu nutzen. Die dort aufgelisteten Referenzorganismen können bei den großen Kultursammlungen erworben werden.

Die Analyse der einzelnen Schritte des Kulturverfahrens kann zu einer verbesserten Gewinnung von Aspergillen führen. Die Verflüssigung von Proben mit Sputolysin oder anderen mukolytischen Mitteln wurde zur Gewinnung von Pilzen vorgeschlagen, die im Schleim von Sputum und Sinusmaterial aus endoskopischen Eingriffen gefangen sind. Die Verwendung von Kartoffeldextrose, Kartoffelflocken, Malzextrakt, hemmendem Schimmelpilzagar oder ähnlichen Sporulationsagaren als primäre Isolationsmedien für Aspergillus spp. kann die Wachstumsrate und die Produktion von Konidien beschleunigen. Der Zusatz von antibakteriellen Wirkstoffen zu Isolationsmedien trägt dazu bei, die Zeit bis zur Identifizierung zu verkürzen, indem das bakterielle Überwachsen gehemmt und die Notwendigkeit einer Subkultur verringert wird. Die anfängliche Bebrütung von Pilzmedien bei 35-37 °C anstelle von oder zusätzlich zu 30 °C kann das Wachstum einiger Aspergillen beschleunigen. Ebenso gewährleistet die tägliche Kontrolle der Nährböden eine frühestmögliche Erkennung. Durch Bebrüten von Kulturplatten in einer mikroaerophilen Umgebung bei 35 °C stellte Tarrand fest, dass ausgewählte, klinisch wichtige Aspergillus spp. auf 12 von 12 Brühkulturen wuchsen. Kulturen der gleichen Organismen, die bei 25 °C ohne CO2 bebrütet wurden, ergaben keine positiven Ergebnisse. Weitere Studien wären hilfreich, um zu klären, welche Medien und Bedingungen für die Gewinnung und rasche Identifizierung klinisch wichtiger Aspergillen am wirksamsten sind.

Mit einer schnellen Scotch-Tape- oder Tease-Mount-Kultur können Konidienköpfe von Aspergillus spp. normalerweise identifiziert werden. Eine Objektträgerkultur kann jedoch erforderlich sein, wenn die Sporulation langsam oder atypisch ist. Das schnelle Tempo der meisten Krankenhauslabors erfordert die einfachste, wenn auch nicht unbedingt die raffinierteste Methode zur Durchführung der Objektträgerkultur. Die klassische Objektträgerkulturmethode von Riddell wurde durch andere, weniger arbeitsintensive Techniken ergänzt. Eine schnelle Methode besteht darin, ein 18 × 18 mm großes Deckglas in einem Winkel von 45 Grad in ein Sporulationsmedium wie Kartoffelflockenagar zu schieben. Wenn der Schimmelpilz sporuliert, wird das Deckglas vorsichtig aus dem Agar herausgezogen und auf einem Objektträger in einen Tropfen Lacto-Phenolblau oder Lacto-Fuchsin eingelegt. Ein weiterer Tropfen wird auf das kleine Deckglas gegeben, bevor der Aufbau mit einem 22 × 22 mm großen Deckglas abgeschlossen wird.

Personalfragen

Eine schnelle Diagnose der Aspergillose hängt nicht nur von einer verbesserten Methodik ab, sondern auch von einer angemessenen, gut ausgebildeten Belegschaft. Erhebungen in mykologischen Praxen empfehlen dringend eine verstärkte Ausbildung. Besonderes Gewicht sollte auf die genaue Identifizierung, die direkte Untersuchung, die angemessene Verwendung von Medien, die klinische Relevanz und die Kosteneffizienz gelegt werden. Eine unzureichende Personalausstattung kann jedoch sowohl die Ausbildung als auch die Durchführung von klinisch relevanteren Verfahren beeinträchtigen. Die ASM-Benchmarking-Umfrage ergab, dass es in einigen mikrobiologischen Labors in den USA nach wie vor an Arbeitskräften mangelt. Der Mangel ist zum Teil darauf zurückzuführen, dass die CLS-Ausbildungsprogramme in den letzten 12 Jahren um 53 % bis 56 % gekürzt wurden. Vierunddreißig Prozent der Fachkräfte, die heute in mikrobiologischen Laboratorien arbeiten, sind über 50 Jahre alt. Werden jüngere Arbeitnehmer zur Verfügung stehen, um sie zu ersetzen, wenn sie in den Ruhestand gehen? Während fast 80 % der weiblichen Arbeitskräfte jünger als 30 Jahre sind, sind nur 10 % der weiblichen Arbeitskräfte in mikrobiologischen Labors unter 30 Jahre alt. Diese Daten deuten darauf hin, dass der Arbeitskräftemangel fortbestehen und sich möglicherweise noch verschärfen wird.

Schlussfolgerung

Die Verbesserung sowohl der traditionellen als auch der nicht-traditionellen Diagnoseverfahren für Mykosen erfordert gleichzeitige Anstrengungen zur Sicherstellung einer angemessenen Zahl von Arbeitskräften und zur Verbesserung der beruflichen Mobilität, der beruflichen Anerkennung, der Möglichkeiten zur Weiterbildung, der Vergütung und anderer Faktoren, die erforderlich sind, um das Interesse an der Laborwissenschaft zu wecken.