Seit den bahnbrechenden Entdeckungen der grundlegenden Prinzipien, die der molekularen Klonierung zugrunde liegen, wurde eine Reihe von Klonierungsstrategien entwickelt, um die Leichtigkeit und Geschwindigkeit zu verbessern, mit der DNA-Fragmente rekombiniert werden können. Informieren Sie sich über die gängigsten Strategien, die beim molekularen Klonen verwendet werden, oder holen Sie sich Ihr gewünschtes Gen mit GenEZ™ ORF-Klonen auf einfache Weise in den gewünschten Vektor. Beginnen Sie mit der Suche nach Ihrem Gen.
Traditionelles Klonen
Traditionelles Klonen, auch PCR-Klonen genannt, erfordert die Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Amplifikation der interessierenden Template-Sequenz (in der Regel das gewünschte Gen) und das Hinzufügen von Restriktionsstellen an den Enden der Sequenz. Restriktionsenzyme werden verwendet, um sowohl die interessierende Vorlage als auch den Zielvektor zu schneiden, und DNA-Ligase wird verwendet, um die klebrigen Enden der Vorlage und des Vektors miteinander zu verbinden. Die herkömmliche Klonierung ermöglicht eine flexible Manipulation der DNA-Sequenz, was den Aufbau nahezu jedes gewünschten Konstrukts erleichtert. Die für das traditionelle Klonen erforderlichen Kontroll- und Optimierungsverfahren können jedoch mühsam und die benötigten Reagenzien teuer sein.
TA-Klonen
TA-Klonen ist eine der einfachsten Formen des Klonens. Bei dieser Methode werden Vektoren mit 5′-Thymin-Überhängen verwendet, um PCR-Produkte aufzunehmen, an die durch die Art der TAQ-Polymerase-Amplifikation zusätzliche 3′-Adenosin-Überhänge angefügt wurden. TA-Klonierung hat den Vorteil der Einfachheit und Schnelligkeit, da kein Restriktionsverdau erforderlich ist. Darüber hinaus enthalten TA-Klonierungskits Reaktionspuffer, die den vorgemischten Vektor, die Ligase und den Puffer enthalten, wodurch die Ligationsreaktionszeit auf nur 5 Minuten reduziert wird. Der Nachteil der TA-Klonierungstechnologie besteht darin, dass die Klonierung nicht direktional ist, d. h. das betreffende Gen kann entweder in der Sense- oder der Antisense-Orientierung in den Zielvektor eingefügt werden. Normalerweise enthält die Hälfte der späteren Transformanten das Gen in der Sense-Richtung und die andere Hälfte in der Antisense-Richtung. Zellen, die mit toxischen Genen transformiert wurden, können jedoch alle die Gene in der Antisense-Richtung aufweisen, da Zellen, die die sinngerichteten Gene enthalten, nicht überleben. Außerdem können überlebende Zellen, die toxische Gene in Sense-Richtung enthalten, mutiert werden, um für ein weniger toxisches Protein zu kodieren.
Nahtlose Klonierung
Nahtlose Klonierungstechnologien machen den Einsatz von Restriktionsenzymen überflüssig. Dies kann von Vorteil sein, wenn ein Insert eine Reihe von Restriktionsstellen in seiner Sequenz enthält, so dass es schwierig ist, Restriktionsenzyme zu finden, die das betreffende Gen während des Klonierungsvorgangs nicht schneiden. Beim nahtlosen Klonen wird die homologe Rekombination genutzt, und es gibt zahlreiche Varianten dieser Technik. Im Allgemeinen besteht das Verfahren aus dem Hinzufügen von flanking-Sequenzen von etwa 15 bp Länge zum Insert und zum Vektor mittels PCR. Mit Hilfe von Exonukleasen werden die Insert- und Vektorsequenzen zurückgeschnitten und die DNA mit Hilfe von Rekombinaseenzymen oder DNA-Ligase verbunden. Die nahtlose Klonierung wurde durch die Entwicklung von Kits vereinfacht, die bereits den Zielvektor und eine proprietäre Mischung der für die Rekombinationsreaktion erforderlichen Enzyme enthalten. Zum Beispiel kann GenScripts GenBuilder™ Kit Inserts bis zu 10 kb in 30 Minuten klonen, und kann auch für Hochdurchsatz-Klonierungsprojekte verwendet werden.
