Relationship between the Size of the Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Reservoir in CD4+ T-Zellen des peripheren Blutes and CD4+:CD8+ T Cell Ratios in Aviremic HIV-1-infected Individuals Receiving Long-Term Highly Active Antiretroviral Therapy

Abstract

Es wurde nachgewiesen, dass die Replikation des Humanen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) bei den meisten infizierten Personen, die eine hochaktive antiretrovirale Therapie (HAART) erhalten, fortbesteht. Es fehlen jedoch Studien, die sich mit der Beziehung zwischen niedrigen Werten der laufenden Virusreplikation und immunologischen Parametern wie dem CD4+:CD8+ T-Zellen-Verhältnis bei diesen Personen befassen. Hier wird eine statistisch signifikante umgekehrte Korrelation zwischen der Häufigkeit von CD4+ T-Zellen, die HIV-1 provirale DNA tragen, und dem CD4+:CD8+ T-Zell-Verhältnis bei infizierten Personen gezeigt, die HAART erhalten und bei denen die Plasmavirämie über längere Zeit unter die Nachweisgrenze gesenkt wurde. Es wurde kein Zusammenhang zwischen der Häufigkeit HIV-1-spezifischer zytotoxischer CD8+ T-Lymphozyten (CTLs) und dem Verhältnis von CD4+ zu CD8+ T-Zellen bei diesen Personen festgestellt. Diese Daten deuten darauf hin, dass eine anhaltende Virusreplikation auf niedrigem Niveau zwar nicht ausreicht, um HIV-1-spezifische CTL-Antworten aufrechtzuerhalten, aber teilweise erklären könnte, warum eine Normalisierung des CD4+ :CD8+ T-Zell-Verhältnisses bei einigen infizierten Personen, die erfolgreich mit HAART behandelt werden, nicht erreicht wird.

Der Einsatz der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) bei der Behandlung von mit dem humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) infizierten Personen hat die klinischen Ergebnisse für viele Infizierte dramatisch verändert und zu einem erheblichen Rückgang der AIDS-Inzidenz und der Sterblichkeit geführt. Allerdings wurde bei den meisten infizierten Personen, bei denen die Plasmavirämie unter die Nachweisgrenze gefallen ist, das Vorhandensein replikationsfähiger Viren, proviraler HIV-1-DNA (einschließlich 2 langer terminaler Repeat-Zirkel), gespleißter und ungespleißter HIV-1-RNA in CD4+ T-Zellen und nicht identifizierter Virusreservoire nachgewiesen, und diese Quellen der laufenden Replikation haben sich als das Haupthindernis bei der Verhinderung der Ausrottung von HIV-1 erwiesen.

Nach Beginn der HAART sinkt die Plasmavirämie bei einem großen Teil der Infizierten rasch unter die Nachweisgrenze, gefolgt von einem allmählichen Anstieg der CD4+ und einem Rückgang der CD8+ T-Zellen. Eine Normalisierung des Verhältnisses von CD4+ zu CD8+ T-Zellen wird jedoch bei einigen infizierten Personen, die ansonsten erfolgreich auf HAART angesprochen haben, nicht erreicht. In diesem Zusammenhang wurde die Vermutung geäußert, dass die chronisch erhöhte Anzahl von CD8+ T-Zellen oder das abnormale Verhältnis von CD4+ zu CD8+ T-Zellen im peripheren Blut durch die aktive Virusreplikation bei infizierten Personen, die unbehandelt sind oder eine suboptimale antivirale Therapie erhalten, bedingt ist. Darüber hinaus hat sich die Expression des Aktivierungsmarkers CD38 auf CD8+ T-Zellen als prognostischer Marker für das Fortschreiten der Krankheit erwiesen. Obwohl vermutet wurde, dass das Scheitern der Normalisierung des Verhältnisses von CD4+ zu CD8+ T-Zellen bei einigen Patienten, die HAART erhalten, auf eine unvollständige Unterdrückung der viralen Replikation zurückzuführen ist, gibt es keine Daten, die diese Frage direkt beantworten, insbesondere bei Patienten, die HAART über einen längeren Zeitraum erhalten haben und bei denen die Plasmavirämie gut unterdrückt wurde.

Es ist erwiesen, dass das Reservoir infizierter CD4+ T-Zellen im peripheren Blut, das durch die Anzahl der Zellen bestimmt wird, die provirale HIV-1-DNA tragen, durch die laufende virale Replikation aufrechterhalten wird, selbst bei sehr niedrigen Werten. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Beziehung zwischen dem Verhältnis von CD4+:CD8+ T-Zellen und der Häufigkeit von CD4+ T-Zellen, die HIV-1 provirale DNA in gereinigten CD4+ T-Zellen tragen, sowie die Häufigkeit von HIV-spezifischen zytotoxischen CD8+ T-Lymphozyten (CTLs) bei infizierten Personen, die über einen längeren Zeitraum HAART erhalten hatten und bei denen die Plasmavirämie unter die Nachweisgrenze gesenkt wurde, wie mit Standardtests bestimmt.

Patienten und Methoden

Isolierung von CD4+ T-Zellen. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) wurden durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation gewonnen. CD4+ T-Zellen wurden aus PBMC von HIV-1-infizierten Personen mit Hilfe einer säulenbasierten Zellseparationstechnik (Stem-Cell Technologies) isoliert, wie an anderer Stelle beschrieben.

Quantitative Echtzeit-HIV-1-DNA-PCR. Zur Bestimmung der Häufigkeit von CD4+ T-Zellen, die HIV-1-Proviren in infizierten Personen tragen, wurde eine Echtzeit-PCR wie unten beschrieben durchgeführt. Genomische DNA wurde aus 1-2 × 106 gereinigten CD4+ T-Zellen unter Verwendung des Puregene DNA-Isolierungskits (Gentra) gemäß den Angaben des Herstellers isoliert. Die DNA (1 µg) wurde dann als Vorlage für die Echtzeit-PCR in einem iCycler (Bio-Rad) verwendet. Die Amplifikationsreaktion wurde in dreifacher Ausführung mit 0,5 µM Primern, 0,2 µM fluoreszierender Sonde, 0,8 µM dNTPs, 5 µM MgCl2 und 2,5 U Platinum Taq Polymerase (Life Technologies) in einem Gesamtvolumen von 50 mL durchgeführt. Die Primer 5′- GGTCTCTCTGGTTAGACCAGAT-30 (5′-Primer) und 5′-CTGCTAGAGATTTTCCACACTG-3′ (3′-Primer) wurden zusammen mit der Fluoreszenzsonde 5′-6FAM-AGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTTAMRA- 3′ verwendet. Die PCR-Bedingungen bestanden aus einem Denaturierungsschritt bei 95°C für 3 min, gefolgt von 45 Zyklen von 15 s bei 95°C und 1 min bei 58°C. Seriell verdünnte ACH-2-DNA wurde ebenfalls der oben genannten PCR unterzogen, um Standardkurven zu erhalten.

Durchflusszytometrische Analyse von HIV-1-spezifischen CD8+ T-Zellen. Die Häufigkeit der HIV-1-spezifischen CD8+ T-Zellen wurde durch Analyse der intrazellulären Interferon-(IFN)-γ-positiven Zellen nach Stimulierung mit HIV-1-spezifischen Peptiden (20 mer mit 15 aa Überlappung) bestimmt. Pools überlappender Peptide (jeweils 1 µg; National Institutes of Health AIDS Reagent Program), die die gesamten HIV-1 gag-, pol-, env- und nef-Sequenzen abdecken, wurden zunächst 10 Minuten lang mit 3 × 106 PBMC in einem 5-mL-Röhrchen mit rundem Boden (Becton Dickinson) in 0,1 mL komplettem Medium in einem CO2-Inkubator bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 0,4 ml komplettes Medium in das Röhrchen gegeben, und nach einer 2-stündigen Inkubation wurde dem Medium Brefeldin A (Sigma) in einer Endkonzentration von 10 mg/ml zugesetzt, um die Sekretion von IFN-γ zu hemmen. Nach 6 Stunden Inkubation wurden die Zellen zweimal gewaschen, mit 1× Fixierlösung (Becton Dickinson) für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixiert und erneut gewaschen. Die Zellen wurden mit 1× Permeabilisierungslösung 2 (Becton Dickinson) permeabilisiert und weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutem Waschen wurden die Zellen mit den folgenden Antikörpern angefärbt: mit Fluorescein-Isothiocyanat-konjugiertem Anti-CD8, mit Phycoerythrin-konjugiertem Anti-IFN-γ, mit Peridinin-Chlorophyll-Protein-konjugiertem Anti-CD69 und mit Allophycocyanin-konjugiertem Anti-CD3-Antikörper (Becton Dickinson). Mit einem Gate auf CD3+CD8+-Lymphozyten wurden ~100.000 Ereignisse mit einem FACSCalibur (Becton Dickinson) gesammelt, und die Häufigkeit von IFN-γ + CD69+-Zellen wurde mit Hilfe der Cellquest-Software (Becton Dickinson) bestimmt.

Statistische Analyse. Die Spearman’sche Rangkorrelation wurde als Maß für die Korrelation zwischen (1) der Häufigkeit von CD4+ T-Zellen, die HIV-1 provirale DNA tragen, und der Anzahl von CD4+ und CD8+ T-Zellen sowie dem Verhältnis von CD4+ zu CD8+ T-Zellen und (2) der Häufigkeit von HIV-1 spezifischen CTLs und der Anzahl von CD4+ und CD8+ T-Zellen, dem Verhältnis von CD4+ zu CD8+ T-Zellen und der Anzahl von CD4+ T-Zellen, die HIV-1 provirale DNA tragen, verwendet. Mit dem exakten Test von Fisher wurde der Zusammenhang zwischen dem Verhältnis CD4+:CD8+ T-Zellen ⩾1,0 oder <1,0 und der Viruslast im CD4+ T-Zellen-Kompartiment ermittelt. Die Bonferroni-Methode zur Anpassung der P-Werte für Mehrfachtests wurde auf die Korrelationen der Anzahl der CD4+ und CD8+ T-Zellen und des CD4+:CD8+ T-Zellen-Verhältnisses mit der Häufigkeit der CD4+ T-Zellen, die provirale HIV-1-DNA tragen, und auf die Korrelationen der Anzahl der CD4+ und CD8+ T-Zellen, des CD4+:CD8+ T-Zellen-Verhältnisses und der Menge an proviraler HIV-1-DNA im CD4+ T-Zellen-Kompartiment mit der Häufigkeit der HIV-1-spezifischen CTLs angewendet.

Ergebnisse

Korrelation zwischen der Größe des CD4+ T-Zell-Reservoirs von HIV-1 und immunologischen Parametern. Um die Beziehung zwischen der Größe des CD4+ T-Zell-Reservoirs für HIV-1 im peripheren Blut und anormalen peripheren immunologischen Parametern bei infizierten Personen, die über einen längeren Zeitraum eine erfolgreiche HAART erhalten, zu untersuchen, haben wir versucht, Korrelationen zwischen der Häufigkeit von CD4+ T-Zellen, die HIV-1 provirale DNA tragen, und der Anzahl der CD4+ und CD8+ T-Zellen sowie dem Verhältnis CD4+ :CD8+ T-Zellen herzustellen. Es bestand eine statistisch signifikante umgekehrte Korrelation zwischen der Häufigkeit der CD4+ T-Zellen, die HIV-1 provirale DNA tragen, und der Anzahl der CD4+ T-Zellen im peripheren Blut der von uns untersuchten infizierten Personen (P = .02; Abbildung 1A). Im Gegensatz dazu wurde keine Korrelation zwischen der HIV-1-Provirus-DNA-Last in CD4+ T-Zellen und der Anzahl der CD8+ T-Zellen gefunden (P = 0,34; Abbildung 1B). Wenn diese beiden immunologischen Parameter kombiniert und als CD4+:CD8+ T-Zell-Verhältnis ausgedrückt wurden, wurde eine starke umgekehrte Korrelation zwischen diesen Werten und der Häufigkeit von CD4+ T-Zellen, die HIV-1 provirale DNA tragen, beobachtet (P .01; Abbildung 1C). Darüber hinaus wiesen 14 (74 %) der 19 Patienten mit einem CD4+:CD8+ T-Zell-Verhältnis von ,1,0 eine HIV-1-DNA-Proviruslast von <1000 Kopien/µg genomischer DNA aus CD4+ T-Zellen auf. Im Gegensatz dazu hatten 10 (77 %) von 13 Patienten mit einem CD4+:CD8+ T-Zell-Verhältnis von >1,0 eine HIV-DNA-Proviruslast von ,1000 Kopien/mg genomischer DNA aus CD4+ T-Zellen (P = .01; Abbildung 1C).

Korrelation zwischen der Häufigkeit von HIV-1-spezifischen CTLs und immunologischen und virologischen Parametern. Es wurde nachgewiesen, dass die Häufigkeit von HIV-1-spezifischen CTLs nach Beginn der HAART bei HIV-1-infizierten Personen aufgrund der abnehmenden Verfügbarkeit von HIV-1-Antigenen allmählich abnimmt. Wir untersuchten den Zusammenhang zwischen der Häufigkeit der HIV-1-spezifischen CTLs und dem Verhältnis von CD4+ zu CD8+ T-Zellen bei infizierten Personen, die über einen längeren Zeitraum erfolgreich auf HAART angesprochen hatten. Es wurde kein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der Häufigkeit von CTLs, die auf HIV-spezifische Peptide reagierten, die von den Genen gag, pol, env und nef abgeleitet sind, und dem Verhältnis von CD4+:CD8+ T-Zellen gefunden (Abbildung 2). Darüber hinaus wurde keine statistisch signifikante Korrelation zwischen der Anzahl der HIV-1-spezifischen CTLs und der Anzahl der CD4+ und CD8+ T-Zellen sowie der Anzahl der CD4+ T-Zellen, die HIV-1 provirale DNA tragen, gefunden (Daten nicht gezeigt). Bemerkenswert ist die Tendenz zu einer höheren Anzahl von CTLs bei Personen mit einem niedrigeren Verhältnis von CD4+ zu CD8+ T-Zellen.

Diskussionen

Der weit verbreitete Einsatz von HAART bei der Behandlung von HIV-1-Erkrankungen hat zu einer dramatischen Verbesserung der klinischen Ergebnisse geführt. Obwohl die Plasmavirämie bei vielen Infizierten, die HAART erhalten, unter der Nachweisgrenze gehalten werden kann, stellt die anhaltend geringe Virusreplikation in den CD4+ T-Zellen ein großes Hindernis bei der Eradikation von HIV-1 dar. In der Tat wird davon ausgegangen, dass die anhaltend niedrige Virusreplikation der Hauptfaktor für die Aufrechterhaltung des HIV-1-Reservoirs ist, was sich in der Häufigkeit von CD4+ T-Zellen widerspiegelt, die provirale HIV-1-DNA bei Patienten tragen, deren Plasmavirämie durch HAART unter die Nachweisgrenze von Standardtests gesenkt wurde. Darüber hinaus wurden bei einem großen Teil der infizierten Patienten, die eine HAART erhalten, dauerhaft erhöhte CD8+ T-Zellzahlen beobachtet. In diesem Zusammenhang wurde vermutet, dass eine aktive virale Replikation für die erhöhten Werte der CD8+ T-Zellen verantwortlich ist und dass die Expression des Aktivierungsmarkers CD38 auf diesen Zellen nachweislich ein prognostischer Marker für das Fortschreiten der Krankheit bei Fehlen einer wirksamen antiviralen Therapie ist .

Trotz fehlender veröffentlichter Daten wurde spekuliert, dass umgekehrte CD4+:CD8+ T-Zell-Verhältnisse im peripheren Blut infizierter Personen, die erfolgreich mit HAART behandelt werden, auf niedrige Werte der laufenden Virusreplikation zurückzuführen sind. In der vorliegenden Studie untersuchten wir, ob die umgekehrten CD4+:CD8+ T-Zell-Verhältnisse bei einigen infizierten Personen, die über einen längeren Zeitraum mit HAART behandelt werden, auf eine unvollständige Unterdrückung der HIV-1-Replikation zurückzuführen sind, was sich in der Größe des HIV-1-Reservoirs an proviraler DNA in CD4+ T-Zellen widerspiegelt. Das anhaltende Vorhandensein von proviraler HIV-1-DNA im CD4+ T-Zellen-Kompartiment bei infizierten Patienten, die eine HAART erhalten, wurde bereits an anderer Stelle überzeugend beschrieben und spiegelt vermutlich die unvollständige Hemmung der verbleibenden viralen Replikation wider, obwohl die Virämie im Plasma auf nicht nachweisbare Werte gesenkt wurde. Wir konnten eine starke inverse Korrelation zwischen der Häufigkeit infizierter CD4+ T-Zellen, die provirale HIV-1-DNA enthalten, und dem Verhältnis von CD4+ und CD8+ T-Zellen nachweisen, was darauf hindeutet, dass niedrige Niveaus der viralen Restreplikation teilweise für das anormale Verhältnis von CD4+:CD8+ T-Zellen im peripheren Blut verantwortlich sein könnten.

Obwohl die Häufigkeit von CD4+ T-Zellen, die provirale HIV-1-DNA tragen, direkt mit dem Verhältnis von CD4+:CD8+ T-Zellen assoziiert sein kann, können andere Faktoren diese Beziehung beeinflussen. Parameter wie das Vorhandensein unbekannter Virusreservoirs, die eine aktive Virusreplikation in Gegenwart von HAART unterstützen, Anomalien im Immunsystem des Wirts, die Wirksamkeit bestimmter Therapieschemata oder andere Störfaktoren können sich sowohl auf die CD4+: CD8+ T-Zellen-Verhältnisse und die proviralen DNA-Lasten im CD4+ T-Zellen-Kompartiment auswirken. Unsere Daten deuten darauf hin, dass eine anhaltende Virusreplikation auf einem Niveau, das mit Standardtests für Plasmavirämie nicht nachweisbar ist, aber das CD4+ T-Zell-Reservoir von HIV-1 aufrechterhält, zwar ausreicht, um eine Normalisierung der CD4+: CD8+ T-Zell-Verhältnisse bei den in dieser Studie untersuchten Patienten zwar ausreichen, aber nicht ausreichen, um HIV-1-spezifische CTL-Antworten aufrechtzuerhalten.

Man könnte argumentieren, dass die anhaltenden abnormalen CD4+:CD8+ T-Zell-Verhältnisse bei infizierten Personen, die über einen längeren Zeitraum eine HAART erhalten, sowohl auf immunologische als auch auf virologische Faktoren zurückzuführen sein könnten. In diesem Zusammenhang wurde nachgewiesen, dass bei fehlender Krankheitsprogression und ausreichender Erholung der CD4+ T-Zellen die Gesamt-T-Zell-Homöostase bei infizierten Personen durch erhöhte Mengen an CD8+ T-Zellen aufrechterhalten wird, die wiederum die Regeneration der CD4+ T-Zellen beeinträchtigen können. Wir konnten jedoch keine Korrelation zwischen der Anzahl der CD4+ T-Zellen, die HIV-1 provirale DNA tragen, und der Anzahl der CD8+ T-Zellen feststellen.

Schließlich haben frühere Studien gezeigt, dass die Bildung von CD4+ T-Zellen im Thymus entweder durch direkte oder indirekte Folgen der aktiven Virusreplikation stark behindert wird. In diesem Zusammenhang wurde bei infizierten Personen eine verringerte Thymusproduktion, gemessen an der Häufigkeit naiver CD4+ T-Zellen, die T-Zellrezeptor-Rearrangement-Exzisionskreise tragen, nachgewiesen. Obwohl nicht klar ist, ob Vorläufer von CD4+ T-Zellen durch HIV-1 im Thymus infiziert werden, deuten unsere Daten stark darauf hin, dass eine unvollständige Unterdrückung der viralen Replikation bei infizierten Personen, die HAART erhalten, die Infektion im CD4+ T-Zellkompartiment im peripheren Blut weiter verbreitet, was zur Aufrechterhaltung des CD4+ T-Zellreservoirs für HIV-1 führt.

Danksagungen

Wir danken Paul Parks für die Planung der Patientenbesuche, Susan Moir für das Lesen dieses Manuskripts und für hilfreiche Diskussionen sowie den Patienten für ihre Teilnahme an dieser Studie.

Figures and Tables