Solution structure, Glykanspezifität und Phenoloxidase-hemmende Aktivität der C-Typ-Lektine CTL4 und CTLMA2 von Anopheles

Erhaltung von CTL4/CTLMA2 bei Anopheles

CTL4 und CTLMA2 bestehen beide aus einem Signalpeptid, einer kurzen N-terminalen Sequenz, die das CXCXC-Motiv enthält, und einer einzelnen CTL-Domäne. Ein kürzlich erschienener Bericht deutet darauf hin, dass die Funktion von CTL4 und CTLMA2 oder ihrer Kofaktoren innerhalb von Anopheles divergiert hat, und insbesondere, dass CTL4 von An. albimanus nicht die N-terminalen Cysteinreste enthält, die an Disulfidbindungen beteiligt sind22. Zunächst untersuchten wir die Orthologe von CTL4 (AGAP005335) und CTLMA2 (AGAP005334), die eng Rücken an Rücken auf Chromosom 2L liegen (Abb. 1a), mithilfe der aktuellen Genmodelle (Stand Februar 2019) in Vectorbase24. Wir fanden Proteine mit einem N-terminalen CXCXC-Motiv für 15/16 CTL4-Orthologe, einschließlich An. albimanus AALB014534, und 13/14 CTLMA2-Orthologe. Wir führten multiple Sequenzalignments sowohl von CTL4 als auch von CTLMA2 aus 10 asiatischen, afrikanischen und Neuwelt-Anopheles-Arten durch (Abb. 1b). Die nicht verwurzelten phylogenetischen Bäume haben eine fast identische Topologie, und ein kombinierter phylogenetischer Baum hat zwei symmetrische Äste, mit Ausnahme der Position von An. dirus in Bezug auf An. funestus und An. maculatus.

Dies unterstützt die Hypothese, dass CTL4 und CTLMA2 innerhalb der Gattung Anopheles konserviert sind, wobei fehlende Orthologe die unvollständige Annotation bestimmter Genome widerspiegeln. Wir untersuchten die genomische Region von drei Arten, für die ein CTL4-Ortholog, aber kein CTLMA2-Ortholog bekannt ist: An. stephensi ASTE002637, An. minimus AMIN007380, und An. melas AMEC014491. Alle besitzen ein nahes oder überlappendes Gen in umgekehrter Ausrichtung – ASTE002636, AMIN007379 und AMEC088499, das zwei CTL-Domänen umfasst. Bei An. stephensi und An. minimus ist der zweiten CTL-Domäne ein CXCXC-Motiv vorangestellt, was darauf hindeutet, dass es sich um CTLMA2-Orthologe handeln könnte. Bei Aedes- und Culex-Mücken ist die Situation weniger klar. Ein CTLMA2-Ortholog, das ein N-terminales CXCXC-Motiv enthält, ist in Ae. albopictus annotiert, AALF001196, und hat ein enges Back-to-Back-invertiertes Zwei-Exon-Gen AALF001195, das eine Serinprotease und eine CTL-Domäne umfasst. Das Genmodell von Oktober 2018 für Ae. aegypti enthält ein CTLMA2-Ortholog mit N-terminalem CXCXC-Motiv, CTLMA14 (AAEL014382), das derzeit als CTL4-Ortholog aufgeführt ist.) Ein CTLMA2-Ortholog ist in C. quinquefasciatus, CPIJ000443, vermerkt, dem jedoch das N-terminale CXCXC-Motiv fehlt. Dies deutet darauf hin, dass CTLMA2 in einem gemeinsamen Vorfahren von Anopheles und Aedes entstanden ist, während CTL4 möglicherweise Anopheles-spezifisch ist.

Biochemische Charakterisierung

An. gambiae CTL4/CTLMA2 (Ag, Fig. 2a,b), CTL4 und CTLMA2 CRDs (Abb. S1a) und An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Aa, Abb. S1b) wurden in Insektenzellen mit dem Baculovirus-Expressionsvektorsystem (BEVS) exprimiert und bis zur Homogenität gereinigt. Reifes AgCTL4 (25-177) hat eine molare Masse von 17,3 kDa und einen pI-Wert von 7,7. Reifes AgCTLMA2 (18-174) hat eine molare Masse von 17,9 kDa und einen pI-Wert von 4,5. Das gereinigte Heterodimer hat auf der nicht-reduzierenden (NR) SDS-PAGE ein Molekulargewicht von 35 kDa (Abb. 2a) und eluiert bei der Größenausschlusschromatographie (SEC) als einzelner Peak mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 40 kDa (Abb. 2b). Monomeres CTL4 und CTLMA2 erscheinen auf der reduzierenden SDS-PAGE mit 17 kDa bzw. 20 kDa. Wie bereits erwähnt, könnte das höhere scheinbare Molekulargewicht von CTLMA2 seine ungewöhnliche (saure) Aminosäureverteilung widerspiegeln20.

Es wurde gezeigt, dass An. gambiae CTL4/CTLMA2 durch ein intermolekulares Disulfid zwischen den Cysteinen des N-terminalen CXCXC-Motivs stabilisiert wird; die Mutation dieser drei Cysteine zu Alanin hebt die Disulfidbildung zwischen den Ketten auf20. Um die Lage des Interchain-Disulfids weiter zu präzisieren, konstruierten wir neun Mutanten, die ein einzelnes Cystein im N-terminalen CXCXC-Motiv von CTL4 und CTLMA2 enthielten, exprimierten die Proteine in Sf9-Zellen und führten Western Blotting zum Nachweis von CTL4 und CTLMA2 durch. Die intermolekulare Disulfidbildung war in allen Fällen ineffizient, aber auf der nicht-reduzierenden SDS-PAGE sichtbar (Abb. 2c).

Dies deutet darauf hin, dass die N-terminale intermolekulare Disulfidbildung zwischen CTL4 und CTLMA2 vielseitig ist und nicht nur einen spezifischen Cysteinrest von jedem Protein betrifft. Wenn die intermolekulare Disulfidbildung promiskuitiv ist, könnten CTL4/CTLMA2-Heterodimere im Prinzip multivalente disulfidverbrückte Oligomere bilden. Bei der NR-SDS-PAGE von An. gambiae CTL4/CTLMA2 werden jedoch keine disulfidverknüpften Oligomere nachgewiesen (Abb. 2a). Während CTL4 und CTLMA2 in vitro20 disulfidverbrückte Homodimere bilden können, ist das gereinigte Produkt überwiegend (>95%) ein Heterodimer. Bei An. albimanus CTL4/CTLMA2 werden auf der NR-SDS-PAGE einige kleinere Banden (~10 %) beobachtet (Abb. S1b), die möglicherweise die Bildung von Homodimeren oder Oligomeren darstellen.

Sowohl An. gambiae CTL4/CTLMA2 als auch An. albimanus CTL4/CTLMA2 sind in Lösung polydispers. Die nicht-kovalente Oligomerisierung höherer Ordnung zeigt sich als Schulter des Hauptpeaks in der SEC mit steigender Konzentration und ist bei An. albimanus CTL4/CTLMA2 stärker ausgeprägt (Abb. S1). Wir bestätigten die Existenz oligomerer Spezies durch analytische Ultrazentrifugation mit Sedimentationsgeschwindigkeit (AUC) (Abb. 2d). Bei einem pH-Wert von 7,5 wird in der c(s)-Verteilung eine Reihe von Spezies mit abnehmender Intensität beobachtet: s1 = 3,1 s, s2 = 4,4 s, s3 = 5,9 s. Die Oligomerisierung ist bei A. gambiae CTL4/CTLMA2 unabhängig von Ca2+, nimmt aber mit Ca2+ bei A. albimanus CTL4/CTLMA2 erheblich mit Ca2+ (Abb. S1b) und ist laut dynamischer Lichtstreuung (DLS) nicht mit dem pH-Wert korreliert (Abb. 2e).

Calciumbindung

Als CTLs können sowohl CTL4 als auch CTLMA2 Calcium binden. Allerdings sind die kanonischen Ca2+-Bindungsreste in CTL4 mutiert, was darauf hindeutet, dass es sich um ein CTLD, aber nicht um ein C-Typ CRD handelt. Daher haben wir die Kalziumbindungsaffinität von An. gambiae CTL4, CTLMA2 und dem CTL4/CTLMA2-Heterodimer von An. gambiae und An. albimanus durch isothermische Titrationskalorimetrie (ITC) gemessen. Unter gleichen Bedingungen wurde eine Bindung für CTLMA2 und CTL4/CTLMA2, aber nicht für CTL4 beobachtet (Abb. 3a-c). Die Bindungskonstanten und thermodynamischen Parameter wurden aus den Ergebnissen von drei unabhängigen Experimenten berechnet (Tabelle 1). Die Ca2+-Bindung von CTLMA2 wird durch ein Single-Site-Modell mit KD = 173 ± 27 μM, ΔH = 12 ± 2 kcal/mol gut beschrieben. Die Affinität von An. gambiae CTL4/CTLMA2 für Calcium ist ~40 × höher als die von CTLMA2 mit KD = 4,9 ± 0,5 μM, ΔH = -23 ± 4 kcal/mol. An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Abb. 3d) hat eine ähnliche Affinität für Calcium mit KD = 2,82 μM, ΔH = -12,1 kcal/mol. Allerdings war die Kalziumbindung sowohl bei An. gambiae als auch bei An. albimanus CTL4/CTLMA2 substöchiometrisch (N = 0,36-0,50).

Glykanbindung

CTL4 und CTLMA2 gehören zur Linie der myeloischen CTLs – einschließlich Makrophagen-Mannose-Rezeptor (MMR) und DC-SIGN – die eine konservierte Familie von Immunrezeptoren in Metazoen bilden15,25. Unter den CTLs mit bekannter Struktur weist CTLMA2 eine 30%ige Sequenzidentität mit der Kohlenhydraterkennungsdomäne (CRD) des Scavenger-Rezeptors der Maus (SCRL, PDB ID 2OX9)26 und des Surfactant-Proteins D des Schweins (SP-D, PDB ID 4DN8)27 auf. CTLMA2 enthält Reste, die mit der Ca2+-Bindung in der Glykanbindungsschleife in Verbindung stehen, sowie das kanonische EPN-Motiv, das mit der D-Mannose-Selektivität verbunden ist (Abb. 4a). Im Gegensatz dazu fehlen bei CTL4 alle mit der Ca2+-Bindung assoziierten Reste, was mit der Tatsache übereinstimmt, dass mit ITC keine Bindung beobachtet wurde. Das einzige CTL mit bekannter Struktur und erheblicher Ähnlichkeit zu CTL4 ist das Faktor IX/X-Bindungsprotein (X-bp) aus dem Gift der chinesischen Mokassinart Deinagkistrodon acutus (1IOD). X-bp ist ein modifiziertes CTLD, bei dem die Glykanbindungsdomäne durch eine lange Schleife ersetzt ist, die die Dimerisierung zur Erzeugung der Faktor IX/X-Bindungsstelle vermittelt. Obwohl einige Insekten-CTLs kein Kalzium für die Glykanbindung benötigen, ist unklar, ob CTL4 überhaupt Glykane binden sollte.

Um ihre Lektinaktivität zu bestimmen, haben wir CTL4, CTLMA2 und das CTL4/CTLMA2-Heterodimer auf Glykan-Arrays analysiert, die 367 einzigartige Glykanstrukturen aufweisen28. Diese Studien zeigten die Bindung an eine Reihe von Glykanen (Tabelle 2). Die Monomere von CTL4 und CTLMA2 zeigten eine Bindung an nur vier bzw. sechs Glykane, während das Heterodimer 18 verschiedene Glykane band. Zwischen den Liganden, die von den einzelnen Monomeren und dem Heterodimer gebunden werden, gibt es erhebliche Unterschiede; 3/4 (75 %) der von CTL4 erkannten Glykane und 2/6 (33 %) der von CTLMA2 erkannten Glykane wurden von CTL4/CTLMA2 nicht erkannt.

Um die Glykan-Array-Ergebnisse zu bestätigen und die Bindungspräferenzen für die CTLs zu bestimmen, wurde eine SPR-Analyse durchgeführt (Tabelle 3). Bei fast allen Interaktionen stimmten das Glykanarray und die SPR-Analyse hinsichtlich des Vorhandenseins von Interaktionen überein, wobei die SPR-Analyse anzeigte, dass das Glykanarray vier falsch negative Ergebnisse lieferte: CTLMA2-Monomer mit H-Antigen, Chondroitinsulfat und Chondroitin-6-sulfat und CTL4-Monomer mit Chondroitin-6-sulfat. Alle falsch negativen Ergebnisse zeigten jedoch eine Bindung auf dem Array mit dem CTL4/CTLMA2-Heterodimer.

Die CTLs erkannten keine mannosehaltigen Glykane, mit Ausnahme von Mannose-6-Phosphat durch CTL4/CTLMA2, trotz des kanonischen EPN-Motivs in CTLMA2. Vielmehr handelt es sich bei den erkannten Strukturen im Allgemeinen um Glykosaminoglykan (GAG)-Motive, die β1-3/β1-4-Bindungen zwischen Glukose (Glc), Galaktose (Gal) und ihren jeweiligen Hexosaminen GlcNac und GalNac umfassen. Die Galβ1-4Glc-Bindung war in 12/23 (52 %) der erkannten Glykane vorhanden, darunter 6/23 (26 %), die Galβ1-4GlcNac enthalten, und 4/23 (17 %), die das Keratan-Motiv Galβ1-4GlcNac β1-3Gal oder GlcNac β1-3Galβ1-4Glc enthalten.

Das Array zeigte auch eine gewisse Vorliebe für polymere und sulfatierte Glykane. Von den vier Glykanen, die von CTL4 erkannt wurden, war der stärkste Treffer für Globopentaose (Gb5, Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc); CTL4 band auch HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n und β1-3Glucan (Glcβ1-4Glc)n. Drei der fünf vom CTLMA2-Monomer erkannten Glykane waren sulfatiert, und das CTL4/CTLMA2-Heterodimer erkannte Chondroitinsulfat und Chondroitin-6-Sulfat, Hyaluronsäure (GlcAβ1-4GlcNAcβ1-3)8 und HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es unterschiedliche und synergistische Effekte der Heterodimerisierung auf die Glykanbindung gibt.

Sowohl CTLMA2 als auch das CTL4/CTLMA2-Heterodimer erkennen mehrere fucosehaltige Zucker, einschließlich Sialyl-LewisX und Sulfo-LewisA, aber nicht Sialyl-LewisA. Die höchste Bindungsaffinität wurde für Sulfo-LewisA mit einer Bindung an den CTLMA2- (106 nM) und CTL4/CTLMA2-Komplex (95 nM) bei einer KD von ~100 nM beobachtet (Tabelle 3). Die höchste Bindungsaffinität von CTL4 wurde auch für ein sulfatiertes Glykan, Sulfo-Lactosamin (292 nM), beobachtet.

Strukturanalyse

Um die Struktur von CTL4 und CTLMA2 weiter zu untersuchen, erstellten wir Strukturmodelle von CTL4 und CTLMA2 (Abb. 4b) mit MODELLER29 und zusätzlicher manueller Bearbeitung. Sowohl CTL4 als auch CTLMA2 haben eine verlängerte Schleife (Schleife 1), die auf die zweite Helix des CTLD folgt (Abb. 4a), mit einer hohen Dichte an komplementär geladenen Resten; basische Reste bei CTL4 und saure Reste bei CTLMA2. Die komplementäre Elektrostatik dieser Schleifen-1-Reste und ihre Nähe zum N-terminalen CXCXC-Motiv legen nahe, dass es sich hier um eine potenzielle Protein/Protein-Schnittstelle innerhalb des Heterodimers handelt (Abb. 4b), für die ein hypothetisches Modell mit einer einzelnen Disulfidbindung im CXCXC-Motiv erstellt wurde. Die Glykan/Ca2+-Bindungsschleifen sind jedoch eine zweite potenzielle Schnittstelle, wie bei den beiden Ketten von D. acutus X-bp beobachtet. Die alternative Hypothese besagt, dass die beiden CTL-Domänen unabhängig voneinander sind und durch flexible Linker über die intermolekulare Hypothese miteinander verbunden sind.

Um diese Hypothese zu testen, haben wir die Lösungsstruktur von CTL4/CTLMA2 durch Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) analysiert. Die Experimente wurden in 0,5 M NaCl, 20 mM CHES pH 9,0, 0,5 mM CaCl2 und 1 % Glycerin durchgeführt, um die Wechselwirkungen zwischen den Partikeln zu minimieren. Unter diesen Bedingungen zeigte das Protein eine lineare Beziehung zwischen der extrapolierten Intensität im Nullwinkel und der Konzentration (I0 vs. c) bis zu einer Konzentration von 3,1 mg/ml. Die puffersubtrahierte Kurve der Intensität I vs. q (Abb. 4c) wurde SAXSMoW2 unterworfen, was RG = 23,0 Å (I0 = 0,61) und ein Molekulargewicht MW = 39 kDa ergibt, nur 11 % größer als das erwartete Heterodimer MW von 35 kDa30. Das berechnete Guinier-Diagramm basiert jedoch nur auf sieben Datenpunkten; die Anpassung über einen erweiterten Bereich (Abb. 4c, Einschub) ergibt RG = 24,5 Å (I0 = 0,64), während die Anpassung der paarweisen Verteilungsfunktion P(r) (Abb. 4d) ein RG = 25,4 Å (I0 = 0,65) ergibt. Die P(r)-Verteilung wurde von DAMMIF31 mit 20 ab initio Perlenmodellen mit einer durchschnittlichen normalisierten strukturellen Diskrepanz NSD = 1,0 ± 0,2 angepasst. Der Hauptkörper der ab initio-Modelle ähnelt in seiner Form dem erwarteten CTL4/CTLMA2-Heterodimer.

Eine zusätzliche Dichte erstreckt sich vom Hauptkörper der Perlenmodelle, die entweder die N-terminale Sequenz beider Proteine einschließlich des CXCXC-Motivs oder eine kleinere Population von CTL4/CTLMA2 mit einem höheren Gyrationsradius widerspiegeln kann. Um diese Hypothese zu testen, führten wir eine Multi-State-Modellierung des SAXS-Profils mit dem Programm MULTIFOXS32 durch. Wir erstellten ein vollständiges Modell für CTL4-6xHis/CTLMA2 mit einer N-terminalen Coiled-Coil, die durch ein intermolekulares Disulfid zwischen CTL4 C39 und CTLMA2 C34 abgeschlossen wird. MULTIFOXS generierte ein Ensemble von 10.000 Varianten des Modells zum Vergleich mit der experimentellen Streukurve. Die einzigen flexiblen Reste waren CTL4 40-45 und 178-183 (6xHis) und CTLMA2 35-39, wobei eine N-terminale Coiled-Coil als starrer Körper die beiden Ketten verbindet. Das beste Ein-Zustands-Modell passte mit χ2 = 1,13 zu den Daten und hatte RG = 23,7 Å. Das Minimum χ2 = 1,07 wurde mit einem 3-Zustands-Modell erreicht (Abb. 4e), bei dem 80 % der Streuung von zwei kompakten Modellen mit RG = 22,0 Å und RG = 23,7 Å beigetragen wird. Diese Daten stimmen mit der Bildung eines kompakten Heterodimers zwischen CTL4 und CTLMA2 überein.

CTL4/CTLMA2 hemmen die Aktivierung der Phenoloxidase als Reaktion auf E. coli

CTL4 und CTLMA2 fungieren als Inhibitoren der Melanisierungsreaktion der Mücke auf die Infektion. Zuvor wurde berichtet, dass die Ausschaltung von CTL4 nicht zu einer erhöhten Phenoloxidase-Aktivität (PO) als Reaktion auf eine Infektion mit einer Mischung aus E. coli und S. aureus führte20. In derselben Studie wurde jedoch festgestellt, dass dsCTL4- und dsCTLMA2-Mücken spezifisch für gramnegative Bakterien empfänglich waren. Daher untersuchten wir erneut die Auswirkungen des Knockdowns von CTL4 und CTLMA2 auf die PO-Aktivität in der Hämolymphe als Reaktion auf eine Infektion mit E. coli (Abb. 5a). 4 Stunden nach der Infektion mit E. coli war die PO-Aktivität bei dsCTL4- (p = 0,02) und dsCTLMA2-Mücken (p = 0,004) im Vergleich zu dsLacZ-Kontrollen deutlich erhöht (Abb. 5b). Die durchschnittliche Knockdown-Effizienz für CTL4 und CTLMA2 betrug 93 ± 3 % bzw. 89 ± 3 %, mit >80 % in jedem einzelnen Experiment.

Die Melanisierung von Plasmodium-Ookinetes nach CTL4/CTLMA2-Silencing ist abhängig von LRIM117,22, TEP133 und SPCLIP133. Da dies alles Elemente der TEP1-ähnlichen Immunantwort sind, gingen wir davon aus, dass die verstärkte PO-Aktivität in Abwesenheit von CTL4 von TEP1 abhängig sein sollte. Dementsprechend verglichen wir die Verstärkung der PO-Aktivität in dsCTL4-Mücken bei gleichzeitiger Verabreichung von dsTEP1 mit der gleichzeitigen Verabreichung von dsLacZ (Abb. 5c). Die durchschnittliche Knockdown-Effizienz für TEP1 betrug 82 ± 9% und >80% in 5/6 Experimenten (64% in einem Experiment). Die PO-Aktivität in dsCTL4-Mücken war nicht signifikant erhöht, wenn TEP1 ebenfalls ausgeschaltet war. Dies bestätigt, dass die Melanisierung in Abwesenheit von CTL4/CTLMA2 TEP1-abhängig ist.

Die gleichzeitige Verabreichung von rekombinantem CTL4/CTLMA2 mit E. coli kehrte die Verstärkung der PO-Aktivität in dsCTL4-Mücken im Vergleich zu BSA signifikant um (p = 0,007, Abb. 5d). Diese Ergebnisse zeigen, dass CTL4/CTLMA2 direkt als negativer Regulator der PO-Aktivität beteiligt ist. In dsLacZ-Mücken hingegen unterdrückte CTL4/CTLMA2 im Vergleich zu Rinderserumalbumin (BSA) nicht die durch E. coli induzierte PO-Aktivität. Außerdem war die durch E. coli ausgelöste PO-Aktivität bei dsCTL4-Mücken, die gleichzeitig mit rekombinanten CTL4/CTLMA2 injiziert wurden (dsCTL4 + CTLs), höher als bei dsLacZ-Mücken, die gleichzeitig mit BSA injiziert wurden (dsLacZ + BSA). Die Injektion von rekombinantem CTL4/CTLMA2 kann also den Verlust des endogenen Proteins nicht vollständig ausgleichen.