Juni 1, 2016 (Vol. 36, Nr. 11)
DeeAnn Visk Ph.D. Gründerin und Hauptautorin von DeeAnn Visk Consulting
Gentherapie muss zelluläre Schutzwälle durchbrechen, ohne den Fall von Jericho in Miniatur nachzustellen
Immuntherapien gegen Krebs, Impfstoffe gegen neue Viren (oder alte Viren an neuen Orten) und Versuche, pathogene Einzelzelldefekte zu beheben – sie alle wollen die Transfektionstechnologie nutzen. Diese Technologie, die verschiedene Methoden zum Einbringen von Nukleinsäuren in Zellen umfasst, ist sehr vielversprechend, birgt aber auch ernsthafte Herausforderungen.
Diese Herausforderungen sind bei den Versuchen zur Gentherapie am deutlichsten zu Tage getreten, bei denen es schwierig war, das Problem der schwer zu transfizierenden Zellen, Organe und ganzen Tiere zu lösen.
Solche Transfektionsherausforderungen wurden von mehreren Biotechnologieunternehmen aufgegriffen. MaxCyte, Lonza und Mirus Bio bieten zum Beispiel die Elektroporation als eine Methode an, die wenig Rückstände hinterlässt. Allerdings ist die Elektroporation nicht für alle Tiere geeignet, so dass andere Methoden erforderlich sind. Eine alternative Technik ist die virale Infektion. Sie wird von Unternehmen wie GenVec eingesetzt.
Eine weitere Herausforderung, die für die virale Transfektion besonders relevant ist, ist die mögliche Stimulierung einer Immunreaktion. Dieser potenzielle Nachteil kann jedoch im richtigen Kontext, nämlich bei der Entwicklung von Impfstoffen, ein echter Vorteil sein. Die Nutzung viraler Transfektionsverfahren für die Entwicklung von Impfstoffen ist eine Spezialität von Thermo Fisher Scientific. Das Unternehmen bietet auch die traditionelle chemisch basierte Transfektion an, die im ganzen Tier funktioniert.
Insgesamt bieten die bisher genannten Unternehmen Technologien an, die alle wichtigen Arten der therapeutisch relevanten Transfektion abdecken: chemisch basierte Transfektion, nicht-chemische Methoden (vor allem Elektroporation) und virale Transduktion. Auch hybride Ansätze werden entwickelt, wie in den folgenden Abschnitten deutlich wird.
Elektroporation
MaxCyte’s Elektroporationsplattform ist GMP-konform und nahtlos skalierbar von der Forschung bis zum kommerziellen Maßstab. „Unser Flow-Elektroporationssystem ermöglicht die Transfektion von einer Million bis zu mehreren hundert Milliarden Zellen in weniger als 30 Minuten in einem vollautomatischen, geschlossenen System“, erklärt Madhusudan V. Peshwa, Ph.D., CSO. Unser System ist sowohl ISO 9000- als auch FDA-konform, so dass es die Anforderungen der therapeutischen Herstellung problemlos erfüllen kann.“
„Wir arbeiten routinemäßig mit Pharma- und Biotech-Unternehmen zusammen, um ex vivo hergestellte Immun- und Stammzelltherapien zu entwickeln. Manchmal geht es darum, Impfstoffe und biologische Arzneimittel mit hoher Ausbeute, wie z. B. Antikörper, schnell herzustellen. In anderen Fällen ermöglichen wir unseren Kunden die Produktion von viralen Vektoren in großem Maßstab mit hohen Titern unter Verwendung von Suspensions- und adhärenten Zellen. Dies hilft nicht nur bei der therapeutischen Entwicklung, sondern kann auch die Arzneimittelforschung beschleunigen.“
Diese Fähigkeit, Zellen in großen oder kleinen Mengen zu verarbeiten, ermöglicht es Wissenschaftlern am Prüfstand, ein Prozessprotokoll mit Durchflusselektroporation für kleine Zellzahlen zu entwickeln. Die Skalierung dieses Prozesses erfolgt dann nahtlos und ohne die üblichen Probleme mit der Aufrechterhaltung der Qualität, da der Transfektionsprozess derselbe bleibt.
„Diese Risikominderung ist für unsere Partner sehr attraktiv. Die Sicherstellung der Konsistenz von der Forschung über die Klinik bis hin zum kommerziellen Maßstab und von Durchlauf zu Durchlauf, von Spender zu Spender und von Patient zu Patient ist entscheidend, um Therapien effizient durch den Entwicklungsprozess zu leiten“, betont Dr. Peshwa.
Während chemische und lipidbasierte Ansätze in der Forschung mit etablierten Zelllinien gut funktionieren, gibt es oft unvorhergesehene Konsequenzen bei der Transfektion von Primärzellen. Darüber hinaus lassen sich diese traditionellen chemischen Methoden zur Transfektion von Zellen nur schwer auf die industrielle Produktion übertragen.
Die Elektroporation, der von MaxCyte verwendete nichtvirale Ansatz, ermöglicht es, dass die Biologie der transfizierten Zellen in jedem Maßstab in einem natürlicheren Zustand bleibt. Indem sie unbeabsichtigte Folgen während des Transfektionsprozesses verhindert, kann die Technologie von MaxCyte die Entstehung von Hindernissen vermeiden und gleichzeitig die Notwendigkeit einer hohen Transfektionseffizienz erfüllen.
„Bei diesen therapeutischen Eingriffen muss praktisch garantiert sein, dass sie nur minimale unbeabsichtigte negative Auswirkungen auf die zu verändernden Zellen haben – die Biologie muss in jeder Phase des Prozesses gleich bleiben“, betont Dr. Peshwa. „Darüber hinaus kann unser Durchfluss-Elektroporations-System automatisiert eingesetzt werden. Es wird in Japan bereits routinemäßig für kommerzielle therapeutische Behandlungen eingesetzt und befindet sich in verschiedenen Stadien der Einführung auf der ganzen Welt.“
Eine weitere Überlegung ist, wo die Transfektion stattfindet. Werden die einem Patienten entnommenen Zellen zur Verarbeitung in eine andere Stadt transportiert? Was passiert, wenn ein Paket verloren geht, sich verzögert oder Temperaturschwankungen unterliegt? Die von MaxCyte angebotene Plattform bietet die Möglichkeit, neue Therapeutika durch die Vor-Ort-Verarbeitung von Patientenzellen zu entwickeln und dabei die großen logistischen und COGS-Probleme anderer Methoden zu umgehen.
Das Engineering von Zellen ist entscheidend für die Entwicklung von zellbasierten Therapeutika. Das Elektroporationssystem von MaxCyte kann eine unbeabsichtigte Veränderung des Zellphänotyps vermeiden und gleichzeitig die wichtigsten Anforderungen des Zell-Engineerings erfüllen: Effizienz, Konsistenz, Übertragbarkeit und Skalierbarkeit, so das Unternehmen.
Virale Transduktionen
Virale Vektoren sind besonders nützlich für die Tranfektion ganzer Tiere oder für die Verwendung mit Geweben, die mit chemischen oder Elektroporationsansätzen schwer zu erreichen sind. GenVec hat sich auf die Verwendung von viralen Vektoren, insbesondere des Adenovirus, spezialisiert, um Gene zu therapeutischen Zwecken zu übertragen.
„Auf den ersten Blick scheinen die Probleme im Zusammenhang mit der Immunreaktion auf virale Vektoren problematisch zu sein“, erklärt Doug Brough, Ph.D. „Wir haben jedoch herausgefunden, dass dies genutzt werden kann, um eine Immunreaktion auf fremdes Material zu stimulieren, so dass Adenoviren zur Verabreichung von Impfstoffen eingesetzt werden könnten.“
In der Tat hat GenVec das Adenovirus gründlich untersucht und mehrere verschiedene „Geschmacksrichtungen“ von Adenoviren entwickelt. Bei der Erforschung von Adenoviren in anderen Spezies, wie Gorillas und Affen, können Forscher Vektoren verwenden, die so konzipiert sind, dass sie die bereits bestehende Immunität der menschlichen Bevölkerung gegen Adenoviren umgehen.“
„Die große Bibliothek von Vektoren, die GenVec anbietet, wird Adenoverse™ genannt“, erklärt Dr. Brough. „Wir haben große Teile des Adenovirus gelöscht, um die mit der Behandlung mit Adenoviren verbundene angeborene Toxizität zu begrenzen. Dies verhindert nicht nur eine schädliche Immunreaktion auf den Vektor, sondern ermöglicht es uns auch, bis zu 12 kb in das Virus einzubauen.“
Durch die Nutzung einer Vielzahl von Ansätzen hat GenVec mit einer Reihe von Unternehmen an verschiedenen Anwendungen, Nukleinsäuretherapeutika und Gen-Editing-Technologien gearbeitet. Modifizierte Adenoviren können sowohl in vitro als auch in vivo Zinkfinger-Ansätze liefern.
Ein Beispiel für eine solche Zusammenarbeit findet sich in der klinischen Studie von Novartis zur Regeneration von Sinneszellen im Innenohr. „Durch die Infektion von Zellen im Innenohr mit einem Gen, das für ein wichtiges regulatorisches Protein kodiert, können neue mechanosensorische Zellen erzeugt werden, um diejenigen zu ersetzen, die aufgrund von Verletzungen oder genetischen Bedingungen verloren gegangen sind“, erklärt Dr. Brough.
Andere gemeinsame Projekte finden sich in Partnerschaften mit Entitäten zur Behandlung von Krebs und zur Entwicklung von Impfstoffen. „Wenn es an der Zeit ist, eine Technologie zu vermarkten, verwendet GenVec eine Zelllinie, die zuvor von der FDA für diese Anwendungen zugelassen wurde“, erläutert Dr. Brough.
„Ein weiterer offensichtlicher Vorteil der Verwendung von Adenoviren ist, dass sie leicht ganze Tiere transfizieren können. Eine verheerende Krankheit bei Nutztieren, die Maul- und Klauenseuche, wird zum Beispiel durch eine Vielzahl von Virustypen übertragen. Unser System könnte es ermöglichen, den Stamm, der einen Ausbruch verursacht, schnell auszutauschen und schnell einen maßgeschneiderten Impfstoff bereitzustellen“, beschreibt Dr. Brough.
Nukleofektion
Lonza bietet eine fortschrittliche Form der Elektroporation namens Nukleofektion™ an, bei der zelltypspezifische Transfektionslösungen in Verbindung mit einem nuancierteren Impulsabgabesystem verwendet werden, das die Transfektion vieler verschiedener Zelltypen, insbesondere normaler primärer menschlicher Zellen, ermöglicht.
„Anstatt Standard-Elektroporationspufferlösungen zu verwenden, setzen wir zelltypspezifische Transfektionslösungen ein“, sagt Gregory Alberts, Ph.D, ein globaler Fachexperte bei Lonza. „Dadurch können wir die Poren, die während der Impulsabgabe entstehen, stabilisieren. Wir vermuten, dass sich die Poren, die bei der Standard-Elektroporation in der Zellmembran entstehen, schnell schließen. Unsere Technologie stabilisiert die durch Elektroporation gebildeten Poren und ermöglicht es dem Material, in die Zelle und insbesondere in den Zellkern zu diffundieren.“
Der Nukleofektionsansatz verwendet viele verschiedene Substrate: DNA, mRNA, siRNA, Peptide, Proteine und kleine Moleküle. Die Transfektionseffizienz für siRNAs und mRNAs ist sehr gut und liegt bei über 90 %. Kleine Peptide transfizieren in der Regel mit etwa 80 % Effizienz, und die Effizienz von Plasmid-DNA liegt je nach Zelltyp zwischen 50 % und 90 %. Selbst große Substrate, größere Proteine wie Antikörper oder bakterielle künstliche Chromosomen (BACs), können mit einer einigermaßen effektiven Transfektionseffizienz in die Zielzellen gelangen.
„Die Nukleoinfektion ist erstaunlich flexibel“, erklärt Dr. Alberts. „Sie wurde für die Transfektion aller Arten von primären menschlichen Zellen verwendet. Sie wurde bei der Erzeugung von iPSC (induzierten pluripotenten Stammzellen), der Transfektion von CRISPR und anderen Genom-Editing-Substraten sowie bei der Transfektion exotischerer Ziele wie der Plasmodium-Familie von Parasiten, die Malaria verursachen, eingesetzt. Auch andere ähnliche Organismen können mit Nucleofection transfiziert werden, um die Erforschung von Tropenkrankheiten zu ermöglichen.“
Die Nucleofection-Plattform ist skalierbar. Das Hochdurchsatz-Nukleofektionssystem kann zum Beispiel 96-Well- und 384-Well-Formate verarbeiten. Häufig wird dieses System in einer zentralen Screening-Einrichtung eingesetzt. Wissenschaftler können den 4D-Nucleofector mit geringerem Durchsatz verwenden, um die Testbedingungen zu optimieren. Da der 4D-Nukleofaktor auf dem Prüfstand die gleichen Transfektionsbedingungen verwendet, mit den gleichen Zellzahlen arbeitet und die gleiche Leistung wie die Geräte mit höherem Durchsatz erbringt, muss der Assay nicht erneut optimiert werden, wenn es an der Zeit ist, auf einen größeren Maßstab umzusteigen.
„Die Kontinuität des Systems ermöglicht den Vergleich von Äpfeln mit Äpfeln, wenn man das Projekt vergrößert oder verkleinert“, erläutert Dr. Alberts.
„Wir sind dabei, ein neues Transfektionsgerät für große Volumina zu testen, das in der Lage sein wird, 200 Millionen bis 1 Milliarde Zellen in einem Format von 1 bis 20 mL zu transfizieren. Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass das Gerät primäre menschliche Zellen oder Zelllinien auf dem gleichen Niveau transfiziert wie die anderen Lonza Nucleofector-Geräte“, fährt Dr. Alberts fort. „Dieses Produkt wird nur für Forschungszwecke freigegeben, obwohl es aufgrund der Fähigkeit von Nucleofection, primäre menschliche Zellen so gut zu transfizieren, zweifellos Interesse an der Verwendung dieses Geräts in eher klinisch orientierten Anwendungen geben wird.“
Dr. Alberts stellt sich vor, dass die Nukleofektion eine Rolle bei innovativen und personalisierten Krebstherapien spielen könnte, wie z.B. bei der CAR-T-Therapie (chimäre Antigen-T-Zellen) sowie bei anderen zellbasierten Therapien, die eine Transfektion oder genomische Veränderung primärer menschlicher Zellen erfordern.
„Die Fähigkeit der Nukleofektion, primäre menschliche T-Zellen einfach und effektiv zu transfizieren, wird bei gentherapeutischen Ansätzen zur Behandlung von Krankheiten Aufmerksamkeit erregen. Lonzas Ansatz für potenzielle Gentherapieanwendungen ist zudem sehr kompakt. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da die bei anderen Transfektionstechniken zurückbleibende Maschinerie zu unbeabsichtigten biologischen Konsequenzen führen kann“, schließt Dr. Alberts.
Wissenschaftler von Lonza haben die Fähigkeit der Nukleoinfektionstechnologie des Unternehmens zur Transfektion von dissoziierten Aortenglattmuskelzellen (AoSMCs) von erwachsenen Ratten untersucht. Kryokonservierte AoSMCs von Ratten wurden aufgetaut und sieben Tage lang in 24-Well-Kulturplatten kultiviert, und die Zellen wurden mit der AD1 4D-Nucleofector Y-Lösung in Adhärenz transfiziert. Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen fixiert und analysiert. Aktin ist in rot dargestellt, GFP in grün.
Formulierungen
Mirus Bio entwickelt und produziert neuartige Transfektionsformulierungen, die eine hocheffiziente und wenig toxische Übertragung vieler verschiedener Arten von Nukleinsäuremolekülen ermöglichen. Viele der Formulierungen sind frei von Bestandteilen tierischen Ursprungs. „Tierversuchsfrei“ ist eine wichtige Eigenschaft für präklinische und klinische Anwendungen.
Das CRISPR-System erfordert die Bereitstellung einer Leit-RNA (gRNA) und die Expression der Cas9-Endonuklease, die in Form von Protein, mRNA oder DNA vorliegen kann. Mirus Bio bietet Transfektionslösungen an, um die effektive Bereitstellung aller verschiedenen Cas9-kodierenden Moleküle zu unterstützen. Bei der Verwendung chemischer Transfektionsmethoden für die Bereitstellung des Cas9-Proteins können Forscher viel geringere Mengen des Proteins verwenden, wenn es mit der gRNA vorkomplexiert ist.
„Bei einigen schwer zu transfizierenden Zelltypen werden höhere Spaltungseffizienzen erzielt, wenn das Cas9-Protein im RNP-Komplex (Ribonukleoprotein) transfiziert wird“, erklärt Laura Juckem, Ph.D., Leiterin der R&D-Gruppe bei Mirus Bio. „Das Mirus TransIT-X2® Dynamic Delivery System liefert effektiv RNP-Komplexe und ermöglicht die Verwendung geringerer Konzentrationen des Cas9-Proteins im Vergleich zur Elektroporation.“
Eine weitere Herausforderung für Unternehmen ist der Wechsel von adhärenten zu Suspensionskulturen, um die große Menge an Material für klinische Studien unterzubringen. Dies gilt insbesondere für die Produktion von rekombinanten Lentiviren und Adeno-assoziierten Viren (AAV). „Wir arbeiten eng mit unseren Kunden zusammen, um sicherzustellen, dass ihre Transfektionen erfolgreich sind und dass Änderungen in ihrem Arbeitsablauf immer noch ein qualitativ hochwertiges Produkt ergeben“, erklärt Dr. Juckem.
„Für die zellbasierte Therapie wurde das CHO-gro® Expressionssystem entwickelt, um hohe Erträge an biotherapeutischen Proteinen in CHO-Suspensionszellen zu erzielen. Dieses optimierte System fördert das Zellwachstum in hoher Dichte und ermöglicht es den Forschern, ausreichend Protein zu gewinnen, um präklinische Studien und erste Charakterisierungsanalysen durchzuführen“, schließt Dr. Juckem.
Dieses Bild aus einer Präsentation von Mirus Bio, in der die hocheffiziente Transfektion von Stammzellen beschrieben wird, zeigt, dass somatische Zellen wie adulte Fibroblastenzellen mit einer Kombination von Transkriptionsfaktoren über mehrere Methoden transfiziert oder transduziert werden können. Sobald die Zellen in einen pluripotenten Zustand umprogrammiert wurden, können sie durch Zugabe von Wachstumsfaktoren und/oder Transfektion von Selektionsmarkern, die durch zelltypspezifische Promotoren gesteuert werden, in verschiedene Stadien gelenkt werden. Das Bild unterstreicht, dass Transfektionsreagenzien an mehreren Stellen in einen Stammzell-Workflow eingefügt werden können.
Ganztieransätze
Thermo Fisher Scientific verfolgt die Bedürfnisse seiner Kunden, biologisch relevantere Daten unter Verwendung von Primärzellen anstelle von immortalisierten Zelllinien zu gewinnen. Primäre Zellen sind traditionell schwieriger mit chemischen Methoden zu transfizieren. Daten, die aus primären Zellkulturen gewonnen werden, liefern jedoch in der Regel Antworten, die sich besser auf In-vivo-Ganztiermodelle übertragen lassen.
Dreidimensionale Zellkulturmodelle, die aussagekräftigere Ergebnisse liefern als zweidimensionale Zellkulturen, sind mit herkömmlichen Methoden schwieriger zu transfizieren.
„Die Transfektion von Primärkulturen mit DNA ist eine Herausforderung. Die direkte Verwendung von siRNA (small inhibitory ribonucleic acid), mRNA (messenger RNA) und Proteinen wird von Primärzellen leichter akzeptiert, da diese Verbindungen nur in das Zytoplasma und nicht in den Zellkern gebracht werden müssen“, erklärt Xavier de Mollerat du Jeu, Ph.D, Dr. Xavier de Mollerat du Jeu, Direktor der Abteilung Forschung und Entwicklung bei Thermo Fisher Scientific.
„Die Abgabe an den Zellkern erfolgt, wenn sich die Zellen teilen“, fährt Dr. de Mollerat fort. „Da sich Primärzellen nicht so leicht teilen wie Zelllinien, können wir das Problem umgehen, indem wir die Moleküle an das Zytoplasma und nicht an den Zellkern abgeben.“
Auf der Suche nach biologisch relevanteren Systemen in ganzen Tieren „haben wir herausgefunden, dass die in vivo-Anwendung von Invivofectamine® 3.0 die Expression eines Proteins in Leberzellen effektiv um 90 % reduzieren kann“, erklärt Dr. de Mollerat. „Diese In-vivo-Anwendung von Invivofectamine gibt den Wissenschaftlern ein effektiveres Modell dafür, wie Behandlungen im ganzen Tier aussehen.“
Eine weitere Anwendung der Transfektionstechnologie ist die Entwicklung von Impfstoffen. Die Zeitspanne für die Entwicklung von Impfstoffen kann erheblich verkürzt werden, wenn transfizierte mRNAs zur Expression von Antigenen verwendet werden, gegen die der Körper eine Immunreaktion entwickeln kann. Angesichts der Vielzahl neuartiger Viren wie Zika und Chikungunya wird die Fähigkeit zur raschen Entwicklung von Impfstoffen die Weltgesundheit erheblich verbessern.
Mit der fortschreitenden Entwicklung von Immuntherapien gegen Krebserkrankungen werden T-Zellen häufig mit spezifischen Rezeptoren angegriffen. „Wir haben mit Unternehmen zusammengearbeitet, die an der Entwicklung dieser Therapien interessiert sind“, erläutert Dr. de Mollerat. „Wir arbeiten eng mit den Unternehmen zusammen, um die Frage zu klären, wie diese Therapien hergestellt werden können, wie sie in großem Maßstab produziert werden können und wie sie weltweit verfügbar gemacht werden können.“
Invivofectamine 3.0 ist ein Reagenz, das von Thermo Fisher Scientific für die In-vivo-RNAi-Verabreichung bereitgestellt wird. Nach Angaben des Unternehmens führt eine einzige Injektion zu einem signifikanten Knockdown am ersten Tag und bis zu drei Wochen lang. Dies ergab eine Studie, in der das Reagenz in verschiedenen Dosierungen (1, 0,5 und 0,25 mg/kg) in den Schwanz eines Nagers injiziert wurde. Das Serum wurde an den Tagen 2, 5, 9, 16, 23 und 30 entnommen und mittels eines chromogenen Assays auf den Knockdown des FVII-Proteins untersucht. Das Unternehmen stellte fest, dass höhere Mengen an siRNA in den injizierten Komplexen zu einem länger anhaltenden Knockdown über den getesteten Bereich führten.