1 Einleitung
tRNA-Faltung und -Stabilität sind entscheidend für eine effiziente Translation, und Defekte in einer der beiden Eigenschaften können zu verminderten tRNA-Mengen führen, was zu Wachstumsdefekten in Hefe und Krankheiten beim Menschen führt (Hopper, 2013; Yarham, Elson, Blakely, McFarland, & Taylor, 2010). In der Hefe Saccharomyces cerevisiae gibt es zwei wichtige zelluläre Qualitätskontrollwege, von denen bekannt ist, dass sie defekte tRNA-Spezies abbauen. Der erste Weg ist der nukleäre Überwachungsweg, der mit Hilfe des nukleären Exosoms und des TRAMP-Komplexes auf prä-tRNA im Zellkern wirkt (Kadaba, Wang, & Anderson, 2006; Vanacova et al, 2005), indem er prä-tRNAiMet abbaut, denen die m1A58-Modifikation fehlt oder die einen falsch verarbeiteten 3′-Anhänger haben (Ozanick et al., 2009), sowie einen Teil der Wildtyp (WT)-prä-tRNAs (Gudipati et al., 2012). Der zweite Weg ist der schnelle tRNA-Zerfall (RTD), der spezifische reife, hypomodifizierte oder destabilisierte tRNA-Arten durch die Aktivität der 5′-3′-Exonukleasen Rat1 und Xrn1 abbaut (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008). RTD wird in Mutanten ausgelöst, denen eine von mehreren Modifikationen im tRNA-Körper fehlt, oder durch destabilisierende Mutationen, und für alle identifizierten RTD-Substrate stellt die Deletion von MET22 die tRNA-Spiegel und das Wachstum vollständig wieder her (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe, Whipple, Chernyakov, Jaramillo, & Phizicky, 2012; Guy et al., 2014; Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008; Whipple, Lane, Chernyakov, D’Silva, & Phizicky, 2011). Es wird vermutet, dass die Unterdrückung von RTD in met22Δ-Stämmen auf die Hemmung der Exonukleasen Rat1 und Xrn1 durch den Metaboliten 3′-Phosphoadenosin-5′-Phosphat zurückzuführen ist, der bei Hemmung von Met22 erhöhte Werte aufweist (Dichtl, Stevens, & Tollervey, 1997; Murguia, Belles, & Serrano, 1996).Es ist bekannt, dass
RTD auf mehrere spezifische tRNA-Spezies einwirkt, die mit sieben Ansätzen identifiziert und untersucht wurden (Abb. 1). Der erste Ansatz bestand in der Verwendung von Microarrays zum genomweiten Vergleich der tRNA-Spiegel in trm8Δ trm4Δ temperatursensitiven Modifikationsmutanten (denen m7G46 und m5C fehlen) und in verwandten Stämmen unter semipermissiven Bedingungen. Auf diese Weise identifizierten wir das RTD-Substrat tRNAVal(AAC), da es in der trm8Δ trm4Δ-Mutante im Vergleich zu WT oder den entsprechenden Einzelmutanten (Alexandrov et al., 2006) reduzierte tRNA-Spiegel aufwies.
Abbildung 1. Verschiedene Ansätze zur Identifizierung und Analyse von RTD-Substraten.
Im zweiten Ansatz wurden Northern Blots verwendet, um sowohl die Geschwindigkeit als auch die Spezifität des tRNA-Abbaus für RTD-Substrate in temperaturempfindlichen Modifikationsmutanten zu untersuchen. Bei diesem Ansatz wurde die RNA, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Temperaturverschiebung aus den Zellen isoliert wurde, auf den Gehalt an spezifischen tRNAs untersucht. Diese Analyse ergab, dass 50 % der tRNAVal(AAC) in einer trm8Δ-trm4Δ-Mutante innerhalb von 30 Minuten nach einer Temperaturverschiebung von 28 auf 37 °C abgebaut wurden, während die ähnlich hypomodifizierten tRNAiMet, tRNAMet und tRNAPhe keine Abnahme zeigten (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008). Darüber hinaus konnten die relativen Mengen an geladener und ungeladener tRNA gemessen werden, indem der Northern Blot unter sauren Bedingungen durchgeführt wurde. Dabei zeigte sich, dass die Mengen an geladener tRNAVal(AAC) innerhalb von 25 Minuten nach der Temperaturverschiebung in einer trm8Δ trm4Δ-Mutante um 50 % reduziert waren und dass die Mengen an ungeladener tRNAVal(AAC) unbeeinflusst blieben (Alexandrov et al, 2006).
Der dritte Ansatz war die tRNA-Suppression mit hoher Kopienzahl, wobei ein Plasmid mit hoher Kopienzahl, das eine bestimmte tRNA exprimiert, in eine temperaturempfindliche tRNA-Modifikationsmutante eingeführt wurde. Wenn es sich bei der tRNA um ein RTD-Substrat handelte und die Temperaturempfindlichkeit das Ergebnis des Abbaus einer einzigen tRNA-Spezies war, würde die Überexpression der tRNA den Defekt unterdrücken. So stellten wir fest, dass die Temperaturempfindlichkeit einer trm8Δ trm4Δ-Mutante durch ein Plasmid mit hoher Kopienzahl, das tRNAVal(AAC) exprimiert, unterdrückt wurde, was darauf hindeutet, dass die Temperaturempfindlichkeit in erster Linie auf den Verlust von tRNAVal(AAC) zurückzuführen ist und dass die fehlenden Modifikationen für die tRNA-Stabilität wichtig sind (Alexandrov et al., 2006). Auch die RTD-Substrate mehrerer anderer tRNA-Modifikationsmutanten wurden mit diesem Ansatz identifiziert, darunter tRNASer(CGA) und tRNASer(UGA) in tan1Δ trm44Δ-Mutanten (denen ac4C12 und Um44 fehlen) und in trm1Δ trm4Δ-Mutanten (denen m2,2G26 und m5C fehlen) (Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe et al., 2012; Kotelawala et al., 2008).
Viertens verwendeten wir einen genetischen Austauschansatz, um RTD-Determinanten in der tRNASer-Familie zu identifizieren, indem wir das einzelne essenzielle tRNASer(CGA)-Gen (SUP61) durch verschiedene tRNASer(CGA)-Varianten im WT- und im met22Δ-Stamm ersetzten und dann das Wachstum bei verschiedenen Temperaturen untersuchten. Mit diesem Ansatz stellten wir fest, dass die kombinierten Akzeptor- und T-Stamm-Stabilitäten starke Determinanten für die FTE-Anfälligkeit in der tRNASer(CGA)-Genfamilie sind (Whipple et al., 2011). Diese Schlussfolgerung wurde durch einen fünften Ansatz zur Messung von RTD unterstützt, bei dem wir in vitro zeigten, dass tRNASer(CGA)-Varianten ohne ac4C12 und Um44 oder mit destabilisierenden Mutationen im Akzeptorstamm anfälliger für den Verdau durch Xrn1 und anfälliger für die Entfernung von 5′-Phosphat durch Kälberdarm-Phosphatase waren (Whipple et al, 2011).
In dieser Übersicht werden wir unsere kürzlich entwickelten sechsten und siebten Ansätze für die Untersuchung von RTD-Substraten diskutieren, die sich als äußerst wertvoll für die Erweiterung unseres Verständnisses des RTD-Wegs erwiesen haben. Der sechste Ansatz verwendet einen Fluoreszenzreporter, um Bibliotheken mit Tausenden von tRNA-Varianten in WT- und met22Δ-Stämmen umfassend zu analysieren. Mit diesem Ansatz haben wir 643 wahrscheinliche RTD-Substratkandidaten identifiziert, viele davon in Regionen, von denen wir aufgrund früherer Arbeiten nicht erwartet hatten, dass sie RTD auslösen (Guy et al., 2014). Wir zeigen Daten, die belegen, dass dieser Ansatz zur Untersuchung der tRNA-Funktion unter verschiedenen Bedingungen verwendet werden kann, und erörtern weitere Anwendungen des Ansatzes.
Der siebte Ansatz verwendet eine Gift-Primer-Verlängerung zur Messung der tRNA-Spiegel in einem WT- und met22Δ-Stamm und ist wertvoll, da er eine tRNA-Variante auch in Gegenwart der WT-tRNA spezifisch messen kann, deren Sequenz sich möglicherweise nur um einen einzigen Rest unterscheidet. Wir stellen eine detaillierte Methodik dieses Ansatzes vor und erörtern einige seiner anderen möglichen Anwendungen.