Tumor-Xenograft

Charakterisierung von Xenograft-Banken

Die Arbeit mit PDX-Tumoren erfordert die Einrichtung und Pflege einer Tumorbank, die in Mäuse implantiert und dann seriell von Generation zu Generation übertragen wird, sofern diese Kette von Ereignissen nicht durch das Einfrieren von Proben unterbrochen wird. Man geht davon aus, dass PDX die morphologischen Merkmale des ursprünglichen Tumors genauer reproduzieren als Xenotransplantate etablierter Zelllinien, was die histologische und genetische Profilierung angeht. Sie geben die Heterogenität menschlicher Krebserkrankungen wieder und eignen sich besser für die Vorhersage des Ansprechens auf eine Behandlung.8-16

Entzündete Läsionen sind im Allgemeinen mit histologischen Methoden leicht zu identifizieren. Im Gegensatz dazu kann es bei Tumoren schwieriger sein, festzustellen, ob es sich um den erwarteten Tumor handelt oder ob er einen anderen Ursprung hat. In der Tat können sich bei Mäusen Tumore an der Stelle von Xenotransplantaten entwickeln. Bei den meisten dieser Tumore handelt es sich um Lymphome (Abb. 4.2B),11 aber manchmal werden auch fusiforme Zellsarkome (Abb. 4.2C) beobachtet, und in seltenen Fällen können auch andere Mäusetumore, wie z. B. Brustdrüsentumore im subkutanen Gewebe weiblicher Mäuse, auftreten. Spontane Tumore oder tumorähnliche Läsionen können sich auch in entfernten Organen entwickeln und als mögliche Metastasen fehlinterpretiert werden (z. B. Lungenadenome; Abb. 4.2D). Eine einfache morphologische Untersuchung des Gewebes zeigt in der Regel eindeutig, ob es sich um denselben Tumortyp handelt wie der ursprüngliche menschliche Tumor. Dies gilt insbesondere für die meisten Xenotransplantate von Karzinomen, deren Morphologie sich stark von derjenigen von Lymphomen oder Sarkomen unterscheidet. Karzinome bestehen im Allgemeinen aus großen Zellen, die deutlich in Strängen, Röhren oder Läppchen mit einem ausgeprägten Bindegewebe angeordnet sind. Lymphome (beim Menschen oder bei der Maus) bestehen aus Blättern kleiner runder Zellen mit spärlichem Stroma, und Sarkome bestehen aus Strömen fusiformer Zellen. Es ist daher leicht, diese verschiedenen Tumorarten mit dem Auge zu unterscheiden. Die Diagnose kann schwieriger sein, wenn es sich bei dem ursprünglichen Tumor um einen „blauen Tumor“ handelt, d. h. einen Tumor, der aus kleinen Zellen mit sehr wenig Zytoplasma und einem hyperchromatischen Kern besteht und unter dem Mikroskop bei geringer Vergrößerung nach einer Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) tief basophil (blau) erscheint. Blastische Tumore, wie das Retinoblastom, sind typischerweise blaue Tumore. In solchen Fällen kann die Tumormorphologie schwer zu interpretieren sein, zumal die spezifischsten Merkmale einiger Tumoren, wie z. B. die Rosetten vieler blastischer Tumoren, in Xenotransplantaten in der Regel fehlen oder nur schlecht dargestellt sind. Anaplastische Tumoren, bei denen die Tumorzellen keine oder nur geringe morphologische Ähnlichkeit mit normalen Zellen aufweisen, können ohne zusätzliche Techniken ebenfalls schwer zu charakterisieren sein. Wie bereits erwähnt, ist es relativ einfach, ein Sarkom von einem Lymphom oder einem gut differenzierten Karzinom zu unterscheiden, während die Unterscheidung von Sarkom-Xenotransplantaten von entzündlichen Läsionen oder Mäusesarkomen schwierig sein kann, da diese Läsionen eine sehr ähnliche Morphologie aufweisen können.6

Wenn es sich um schwierige Fälle handelt oder einfach nur, um vor Beginn eines Experiments zu bestätigen, dass ein Tumor tatsächlich menschlichen Ursprungs ist, können verschiedene Methoden zum Nachweis speziesspezifischer Proteine oder Nukleotidsequenzen auf der Grundlage von Immunhistochemie oder In-situ-Hybridisierung eingesetzt werden, um menschliche oder murine Zellen zu identifizieren. Die immunhistochemische Charakterisierung von Proteinen, die für eine Zelllinie charakteristisch sind, ist nützlich, um das Ursprungsgewebe des Tumors zu spezifizieren.

Besonders zu beachten ist die mögliche Entwicklung menschlicher Lymphome am Ort des Engraftments nicht-lymphoider Tumoren, vor allem während der Erstimplantation.11 Solche Tumoren tragen die spezifischen Marker menschlicher Zellen; dies kann zur Verwechslung mit einem echten Xenotransplantat führen, wenn keine morphologische Untersuchung der Läsion durchgeführt wird. In PDX-Studien scheinen sich die meisten der beobachteten menschlichen Lymphome aus Lymphozyten zu entwickeln, die in der für das ursprüngliche Engrafting verwendeten Gewebeprobe vorhanden sind. Wenn diese Zellen mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) infiziert sind, können sich die B-Lymphozyten in Tumorzellen umwandeln.17,18 Diese Zellen werden bei immunkompetenten Menschen vom Immunsystem effizient eliminiert, während ihre Transplantation in immungeschwächten Mäusen dazu führt, dass sich die malignen B-Zellen entwickeln und an die Stelle des ursprünglichen menschlichen Tumors treten.11 Einige wenige Fälle von EBV-negativen peripheren humanen T-Zell-Lymphomen wurden auch im PDX-Kontext beschrieben.19 Wenn der ursprüngliche humane Tumor eindeutig kein Lymphom war (z. B. ein Adenokarzinom), dann ist die Entwicklung eines humanen Lymphoms leicht zu handhaben, da eine einfache morphologische Untersuchung ausreicht, um zu zeigen, dass der an der Transplantationsstelle wachsende Tumor nicht vom erwarteten Typ ist und daher verworfen werden sollte. Wenn der ursprüngliche Tumor ein „blauer Tumor“ war, kann der Nachweis, dass der an der Transplantationsstelle gefundene Tumor menschlichen Ursprungs ist, ohne weitere Charakterisierung zu einer Fehlinterpretation führen, da es sich bei diesem Tumor in Wirklichkeit um ein menschliches Lymphom handeln kann, das aus der malignen Transformation von EBV-infizierten Lymphozyten im ursprünglichen Tumor entstanden ist, wie bereits erwähnt.

Wenn ein Xenotransplantat etabliert ist (PDX-Tumore gelten im Allgemeinen nach drei bis fünf Passagen als stabilisiert20), sollte es sowohl hinsichtlich seiner histologischen Art als auch seiner Differenzierung charakterisiert werden. Der histologische Typ des Tumors bleibt in Xenografts in der Regel gut erhalten, so dass z. B. Epidermoidkarzinome und tubuläre Adenokarzinome die gleichen Merkmale aufweisen, wenn sie PDX bilden.21 Es wird angenommen, dass diese phänotypische Stabilität mit der biochemischen Stabilität zusammenhängt, da ausgeprägte biochemische Veränderungen wahrscheinlich nicht zur Erhaltung der morphologischen Merkmale führen würden.6 Die erste Frage, die sich der Pathologe daher stellen muss, ist, ob der vorliegende Tumor die morphologischen und biochemischen Merkmale des Ausgangsgewebes reproduziert.17 Wenn dies nicht der Fall ist, könnte es sich um einen murinen Tumor handeln, oder es könnte eine größere Veränderung im Differenzierungsmuster des Tumors stattgefunden haben, was weitere Untersuchungen erfordern würde.8

Bei einigen Transplantaten der ersten Generation und in zunehmendem Maße nach weiteren Passagen können einige Tumoren jedoch dazu neigen, weniger differenziert zu sein, mit weniger Gängen oder Azini in Adenokarzinomen und einer höheren Rate an Mitose, Kernpleomorphismus und Atypie.20

Spezifische morphologische Details können sich während der seriellen Passagen ändern, z. B. mit dem Erwerb einer Muzinsekretion oder einer neuroendokrinen Differenzierung, die beide Kriterien für die Tumorprogression bei einigen Karzinomen (z. B. Prostatakrebs) sind.22 In ähnlicher Weise kann das Muster der Tumordifferenzierung durch Änderungen der Transplantationsbedingungen verändert werden, z. B. durch Änderungen des Hormonstatus des Wirts aufgrund von Kastration oder Hormonergänzung.22

Die Feststellung, ob die Morphologie des Tumors nach der Transplantation, nach seriellen Passagen oder nach Experimenten erhalten bleibt, ist eine der Schwierigkeiten, mit denen Pathologen konfrontiert sind. Unabhängige Xenotransplantate desselben Tumors sind aufgrund der biologischen Variabilität und der Intratumorheterogenität nie völlig identisch. Selbst verschiedene Abschnitte desselben Tumors und verschiedene Regionen desselben Abschnitts können morphologische Unterschiede aufweisen. Die morphologischen Merkmale der Zellen und ihrer Kerne, ihre räumliche Anordnung, der Mitoseindex und das Vorhandensein atypischer Mitosen, die Anzahl der apoptotischen Körper und die Häufigkeit von Nekrosen, die Fülle des Stromas und das Gefäßsystem unterscheiden sich von Schnitt zu Schnitt und von Feld zu Feld. Der Pathologe muss daher feststellen, ob das Gesamtmuster des Tumors erhalten bleibt und, was noch wichtiger ist, ob die Histologie des xenotransplantierten Tumors der des ursprünglichen Spendertumors entspricht. Internationale Klassifizierungen menschlicher Tumoren sollten als Grundlage für eine genaue pathologische Klassifizierung von Xenotransplantaten verwendet werden, doch ist ein gewisses Maß an Flexibilität erforderlich, da Xenotransplantate die Morphologie des ursprünglichen menschlichen Tumors nie perfekt reproduzieren.

Wenn Xenotransplantate über aufeinanderfolgende Passagen oder während Experimenten verfolgt werden, können qualitative Veränderungen, wie z.B. ein Wechsel von einem trabekulären zu einem röhrenförmigen Muster, wenn sie reproduzierbar sind, als signifikant angesehen werden, wohingegen quantitative Veränderungen, wie z.B. Veränderungen des Mitoseindex oder des Ausmaßes der Nekrose, insbesondere wenn sie subtil sind, mit großer Vorsicht interpretiert werden sollten.

Eine weitere Schwierigkeit bei der histologischen Analyse von Tumor-Xenobanken ergibt sich aus der teilweise subjektiven Natur der morphologischen Analyse. Wenn Beobachter die Morphologie eines bestimmten Tumortyps gut kennen, dann ist ihre Wahrnehmung fein abgestimmt, um kleine Details zu erkennen, die mit der Zeit deutlicher werden können. Es ist ratsam, eine stabilisierte PDX-Probe als Referenz für den Vergleich mit neuen Proben auszuwählen, um sicherzustellen, dass die Objektträger so objektiv wie möglich gelesen werden. Eine digitale Bank mit virtuellen Objektträgern kann diese Aufgabe erheblich erleichtern. Wenn kein offensichtlicher Unterschied zwischen dem Testobjektträger und dem Referenzobjektträger festgestellt werden kann, kann die Läsion als „ähnlich“ angesehen werden; das bedeutet nicht, dass sie identisch sind, sondern nur, dass keine signifikanten morphologischen Veränderungen festgestellt werden können.

Für die erste Probe, die in einem Xenotransplantatversuch beobachtet wird, sollte die Referenz eine Probe des ursprünglichen menschlichen Tumors sein oder zumindest eine morphologische Beschreibung als der betreffende Tumor im Pathologiebericht des Patienten haben. Ist keine solche Referenz vorhanden, kann der Pathologe einfach sagen, dass der Tumor „morphologisch kompatibel“ mit einem Xenotransplantat eines menschlichen Tumors einer bestimmten Kategorie ist.