Cheadle se hizo acreedor a su tarjeta del Screen Actors Guild (SAG) cuando apareció como empleado de una hamburguesería en la comedia de 1985 Moving Violations. En 1987, recibió un pequeño papel en la temporada 7, episodio 19 de Hill Street Blues, donde interpretó a un adolescente con dificultades de aprendizaje. A esto le siguió una aparición en Hamburger Hill el mismo año; Cheadle consiguió el papel de Jack en el episodio «Jung and the Restless» de Night Court del 1 de abril de 1988. Aunque su personaje tenía 16 años, Cheadle tenía 23 en ese momento.
Cheadle interpretó entonces el papel de Rocket en la película de 1988 Colors. En 1989, apareció en un vídeo para el éxito número 2 de Angela Winbush, «It’s the Real Thing», realizando movimientos de baile con un mono naranja, trabajando en un lavadero de coches. En 1990, apareció en un episodio de The Fresh Prince of Bel-Air titulado «Homeboy, Sweet Homeboy», interpretando al amigo de Will Smith y primer interés amoroso de Hilary, Ice Tray. En 1992, interpretó un papel secundario en el spin-off de The Golden Girls, The Golden Palace. Posteriormente, Cheadle interpretó al fiscal del distrito John Littleton en tres temporadas de Picket Fences.
Cheadle recibió por primera vez un gran reconocimiento por su interpretación de Mouse Alexander en la película Devil in a Blue Dress, por la que ganó el premio al mejor actor de reparto de la Asociación de Críticos de Cine de Los Ángeles y de la Sociedad Nacional de Críticos de Cine, y fue nominado a premios similares del Sindicato de Actores y de los Premios de la Imagen de la NAACP. Poco después actuó en el papel principal del telefilme de HBO de 1996 Rebound: La leyenda de Earl «La Cabra» Manigault. También protagonizó la película de 1997 Volcano, dirigida por Mick Jackson. También protagonizó Rush Hour 2, con Jackie Chan y Chris Tucker.
Los créditos televisivos de Cheadle incluyen actuaciones nominadas al Emmy en las películas The Rat Pack, A Lesson Before Dying, Things Behind the Sun y en una aparición como invitado en ER. En la novena temporada de la serie, interpretó a Paul Nathan, un estudiante de medicina que lucha contra la enfermedad de Parkinson. Ha aparecido en películas como Rosewood, The Family Man, Boogie Nights, Out of Sight, Traffic y Ocean’s Eleven. Estas tres últimas fueron dirigidas por Steven Soderbergh. Hizo un cameo en la película Abby Singer. En 2005, Cheadle fue nominado al Oscar al mejor actor por su interpretación de Paul Rusesabagina en la película Hotel Rwanda. También protagonizó y coprodujo Crash, que ganó el Oscar a la mejor película en 2006. Por su actuación en Crash, Cheadle fue nominado a los premios BAFTA y del Sindicato de Actores al mejor actor de reparto. Interpretó al protagonista de la película Traidor.
En marzo de 2007, Cheadle protagonizó junto al cómico Adam Sandler Reign Over Me, de Mike Binder, una comedia-drama sobre un hombre que se ha alejado de la realidad tras la muerte de su mujer y sus tres hijas en el 11-S. La película fue un fracaso de taquilla, con una recaudación nacional de 22,2 millones de dólares. Posteriormente, Cheadle protagonizó la película de DreamWorks Pictures de 2009 Hotel para perros. Cheadle iba a debutar como director con la adaptación de Tishomingo Blues, de Elmore Leonard, pero en julio de 2007 declaró: «‘Tishomingo’ está muerto…»
Cheadle apareció en anuncios de la NFL para promocionar la Super Bowl desde 2002 hasta 2005. Apareció con tanta regularidad para la NFL en su publicidad de la Super Bowl que, en 2006, en una campaña para que los aficionados presentaran sus propias ideas publicitarias, la NFL le pidió permiso para hacer referencia a sus anuncios anteriores y así dar la impresión de no tener nuevas ideas: «rápidamente aprobó la idea y la encontró divertida». Abe Sutton (junto con Etan Bednarsh), uno de los finalistas de este concurso de la NFL, jugó con este anuncio proponiendo un anuncio en el que cada jugador de un equipo de fútbol americano es Don Cheadle.
En 2009, Cheadle y el creador de Boondocks, Aaron McGruder, trabajaron en un posible programa de comedia en la NBC. El «proyecto gira en torno a hermanos desparejados que se reúnen para abrir una empresa de seguridad privada». Cheadle y McGruder estaban programados para actuar como productores ejecutivos, mientras que se esperaba que McGruder escribiera el guión.
También en 2009, Cheadle actuó en The People Speak (El pueblo habla), un largometraje documental que utiliza interpretaciones dramáticas y musicales de las cartas, diarios y discursos de los estadounidenses de a pie, basado en la obra del historiador Howard Zinn A People’s History of the United States.
En 2010, Cheadle asumió el papel de Máquina de Guerra / James Rhodes en Iron Man 2 (2010), en sustitución de Terrence Howard. Cheadle retomó este papel en Iron Man 3 (2013), Vengadores: La era de Ultrón (2015), Capitán América: Civil War (2016), Vengadores: Infinity War (2018), y Vengadores: Endgame (2019), El halcón y el soldado de invierno (2021) y retomará el papel en la próxima serie de Disney+ Armor Wars.
De 2012 a 2016, Cheadle protagonizó la serie de televisión de Showtime House of Lies. En 2013, ganó el Globo de Oro como mejor actor en una serie de comedia por su papel en la serie.
Ceadle pasó diez años escribiendo y produciendo la película Miles Ahead (2016), basada en la vida del músico de jazz Miles Davis. Cheadle también dirigió y protagonizó la película. Las localizaciones para la película se encontraron en Cincinnati.
En 2018, Cheadle actuó como invitado en el final de la primera temporada de DuckTales, proporcionando la nueva caja de voz del Pato Donald. Más tarde volvió a ser invitado en 2020 durante la tercera temporada, después de que un deseo que Donald pidió a Gene el Genio alterara la realidad.