Estructura en solución, glycan specificity and of phenol oxidase inhibitory activity of Anopheles C-type lectins CTL4 and CTLMA2

Conservation of CTL4/CTLMA2 in Anopheles

CTL4 and CTLMA2 both consist of a signal peptide, a short N-terminal sequence containing the CXCXC motif, and a single CTL domain. Un informe reciente sugirió que la función de CTL4 y CTLMA2 o sus cofactores han divergido dentro de Anopheles, y específicamente que An. albimanus CTL4 no contiene los residuos de cisteína N-terminal involucrados en los enlaces disulfuro22. Primero reexaminamos los ortólogos de CTL4 (AGAP005335) y CTLMA2 (AGAP005334), que tienen una orientación cercana espalda con espalda en el cromosoma 2L (Fig. 1a), utilizando los modelos de genes actuales (a partir de febrero de 2019) en Vectorbase24. Encontramos proteínas con un motivo CXCXC N-terminal para 15/16 ortólogos de CTL4, incluido An. albimanus AALB014534, y 13/14 ortólogos de CTLMA2. Realizamos alineaciones de secuencias múltiples de CTL4 y CTLMA2 de 10 especies de Anopheles de Asia, África y el Nuevo Mundo (Fig. 1b). Los árboles filogenéticos no enraizados tienen una topología casi idéntica, y un árbol filogenético combinado tiene dos ramas simétricas, excepto por la posición de An. dirus con respecto a An. funestus y An. maculatus.

Esto apoya la hipótesis de que CTL4 y CTLMA2 se conservan dentro del género Anopheles, y que los ortólogos que faltan reflejan una anotación incompleta de ciertos genomas. Examinamos la región genómica de tres especies con un ortólogo de CTL4 pero sin ortólogo de CTLMA2: An. stephensi ASTE002637, An. minimus AMIN007380 y An. melas AMEC014491. Todos poseen un gen cercano o superpuesto en orientación inversa – ASTE002636, AMIN007379 y AMEC088499, que comprende dos dominios CTL. En el caso de An. stephensi y An. minimus el segundo CTL está precedido por un motivo CXCXC, lo que sugiere que pueden ser ortólogos de CTLMA2. En los mosquitos Aedes y Culex, la situación es menos clara. Un ortólogo de CTLMA2 que incluye un motivo CXCXC N-terminal está anotado en Ae. albopictus, AALF001196, y tiene un gen cercano de dos exones invertidos AALF001195, que comprende una serina proteasa y un dominio CTL. El modelo genético de octubre de 2018 para Ae. aegypti incluye un ortólogo de CTLMA2 con motivo CXCXC N-terminal, CTLMA14 (AAEL014382), actualmente catalogado como un ortólogo de CTL4). Un ortólogo de CTLMA2 está anotado en C. quinquefasciatus, CPIJ000443, pero carece del motivo N-terminal CXCXC. Esto sugiere que CTLMA2 surgió en un ancestro común de Anopheles y Aedes mientras que CTL4 puede ser específico de Anopheles.

Caracterización bioquímica

An. gambiae CTL4/CTLMA2 (Ag, Fig. 2a,b), CTL4 y CTLMA2 CRDs (Fig. S1a), y An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Aa, Fig. S1b) se expresaron en células de insecto utilizando el sistema de vectores de expresión de baculovirus (BEVS) y se purificaron hasta su homogeneidad. El AgCTL4 maduro (25-177) tiene una masa molar de 17,3 kDa y pI 7,7. El AgCTLMA2 maduro (18-174) tiene una masa molar de 17,9 kDa y pI 4,5. El heterodímero purificado tiene un peso molecular en SDS-PAGE no reductor (NR) de 35 kDa (Fig. 2a) y eluye como un único pico en cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) con un peso molecular aparente de 40 kDa (Fig. 2b). Los CTL4 y CTLMA2 monoméricos aparecen en SDS-PAGE reductor a 17 kDa y 20 kDa, respectivamente. Como se señaló anteriormente, el mayor peso molecular aparente de CTLMA2 puede reflejar su inusual distribución de aminoácidos (ácidos)20.

Se ha demostrado que la CTL4/CTLMA2 de An. gambiae está estabilizada por un disulfuro intermolecular entre las cisteínas del motivo CXCXC N-terminal; la mutación de estas tres cisteínas a alanina anula la formación del disulfuro entre cadenas20. Para precisar aún más la localización del disulfuro entre cadenas, construimos nueve mutantes que contenían una sola cisteína en el motivo N-terminal CXCXC de CTL4 y CTLMA2, coexpresamos las proteínas en células Sf9 y realizamos Western Blotting para detectar CTL4 y CTLMA2. La formación de disulfuro intermolecular fue ineficaz pero evidente en SDS-PAGE no reductor en todos los casos (Fig. 2c).

Esto sugiere que la formación de disulfuro intermolecular N-terminal entre CTL4 y CTLMA2 es promiscua, en lugar de implicar un residuo de cisteína específico de cada proteína. Si la formación de disulfuro intermolecular es promiscua, los heterodímeros CTL4/CTLMA2 podrían, en principio, formar oligómeros multivalentes unidos por disulfuro. Sin embargo, no se detectan oligómeros unidos por disulfuro en NR-SDS-PAGE para CTL4/CTLMA2 de An. gambiae (Fig. 2a). Del mismo modo, mientras que CTL4 y CTLMA2 pueden formar homodímeros unidos por disulfuro in vitro20, el producto purificado es abrumadoramente (>95%) heterodímero. Se observan algunas bandas menores (~10%) en NR-SDS-PAGE para An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1b) que pueden representar la formación de homodímeros u oligómeros.

Tanto An. gambiae CTL4/CTLMA2 como An. albimanus CTL4/CTLMA2 son polidispersos en solución. La oligomerización no covalente de orden superior es evidente como un hombro del pico principal en la SEC con el aumento de la concentración, y es más pronunciada para An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1). Confirmamos la existencia de especies oligoméricas mediante ultracentrifugación analítica a velocidad de sedimentación (AUC) (Fig. 2d). A pH 7,5 se observa una serie de especies de intensidad decreciente en la distribución c(s): s1 = 3,1 s, s2 = 4,4 s, s3 = 5,9 s. La oligomerización es independiente del Ca2+ para A. gambiae CTL4/CTLMA2 pero aumenta sustancialmente con el Ca2+ para A. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1b), y no está correlacionada con el pH según la dispersión dinámica de la luz (DLS) (Fig. 2e).

Unión del calcio

Como CTLs, tanto CTL4 como CTLMA2 pueden unir el calcio. Sin embargo, los residuos canónicos de unión al Ca2+ en CTL4 están mutados, lo que sugiere que puede ser un CTLD pero no un CRD de tipo C. Por lo tanto, medimos la afinidad de unión al calcio de CTL4 de An. gambiae, CTLMA2 y el heterodímero CTL4/CTLMA2 de An. gambiae y An. albimanus mediante calorimetría de valoración isotérmica (ITC). En condiciones equivalentes, se observó la unión para CTLMA2 y CTL4/CTLMA2, pero no para CTL4 (Fig. 3a-c). Las constantes de unión y los parámetros termodinámicos se calcularon a partir de los resultados de tres experimentos independientes (Tabla 1). La unión a Ca2+ de CTLMA2 se ajusta bien a un modelo de sitio único con KD = 173 ± 27 μM, ΔH = 12 ± 2 kcal/mol. La afinidad de An. gambiae CTL4/CTLMA2 por el calcio es ~40 × mayor que CTLMA2 con KD = 4,9 ± 0,5 μM, ΔH = -23 ± 4 kcal/mol. An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. 3d) tiene una afinidad similar por el calcio con KD = 2,82 μM, ΔH = -12,1 kcal/mol. Sin embargo, la unión del calcio tanto a An. gambiae como a An. albimanus CTL4/CTLMA2 fue subestequiométrica (N = 0,36-0,50).

Unión a glicanos

Los CTL4 y CTLMA2 pertenecen al linaje de CTLs mieloides -incluyendo el receptor de manosa de los macrófagos (MMR) y el DC-SIGN- que forman una familia conservada de receptores inmunes en los metazoos15,25. Entre los CTL con estructura conocida, CTLMA2 tiene un 30% de identidad de secuencia con el dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD) del receptor scavenger de ratón (SCRL, PDB ID 2OX9)26 y la proteína surfactante D porcina (SP-D, PDB ID 4DN8)27. CTLMA2 conserva residuos asociados a la unión del Ca2+ en el bucle de unión del glicano, y el motivo canónico EPN asociado a la selectividad de la D-manosa (Fig. 4a). Por el contrario, CTL4 carece de todos los residuos asociados con la unión al Ca2+, lo que concuerda con el hecho de que no se observó ninguna unión por ITC. El único CTL de estructura conocida con considerable similitud a CTL4 es la proteína de unión al factor IX/X (X-bp) del veneno del mocasín chino Deinagkistrodon acutus (1IOD). La X-bp es una CTLD modificada en la que el dominio de unión al glicano se sustituye por un largo bucle que media en la dimerización para generar el sitio de unión al factor IX/X. Por lo tanto, aunque algunos CTL de insectos no requieren calcio para la unión de glicanos, no está claro si CTL4 debería unir glicanos en absoluto.

Para definir su actividad lectina, analizamos CTL4, CTLMA2 y el heterodímero CTL4/CTLMA2 en matrices de glicanos que muestran 367 estructuras de glicanos únicas28. Estos estudios demostraron la unión a una serie de glicanos (Tabla 2). Los monómeros de CTL4 y CTLMA2 demostraron la unión a sólo cuatro y seis glicanos, respectivamente, mientras que el heterodímero se unió a 18 glicanos diferentes. Hay una diferencia apreciable entre los ligandos unidos por los monómeros individuales y el heterodímero; 3/4 (75%) de los glicanos reconocidos por CTL4 y 2/6 (33%) de los glicanos reconocidos por CTLMA2 no fueron reconocidos por CTL4/CTLMA2.

Para confirmar los resultados de la matriz de glicanos y determinar las preferencias de unión para los CTL, se realizó un análisis SPR (Tabla 3). En casi todas las interacciones el array de glicanos y el SPR coincidieron en la presencia de interacciones con el SPR indicando que el array de glicanos tenía cuatro resultados falsos negativos: CTLMA2 monómero con antígeno H, condroitín sulfato y condroitín-6-sulfato, y CTL4 monómero con condroitín-6-sulfato. Sin embargo, todos los resultados falsos negativos mostraron unión en el array con el heterodímero CTL4/CTLMA2.

Los CTLs no reconocieron los glicanos que contienen manosa, con la excepción de la manosa-6-fosfato por CTL4/CTLMA2, a pesar del motivo canónico EPN presente en CTLMA2. Más bien, las estructuras reconocidas son generalmente motivos de glicosaminoglicanos (GAG) que comprenden enlaces β1-3/β1-4 entre glucosa (Glc), galactosa (Gal) y sus respectivas hexosaminas GlcNac y GalNac. El enlace Galβ1-4Glc estaba presente en 12/23 (52%) de los glicanos reconocidos, incluyendo 6/23 (26%) que contenían Galβ1-4GlcNac y 4/23 (17%) que contenían el motivo de queratán Galβ1-4GlcNac β1-3Gal o GlcNac β1-3Galβ1-4Glc.

La matriz también mostró cierta preferencia por los glicanos poliméricos y sulfatados. De los cuatro glicanos reconocidos por CTL4, el resultado más fuerte fue para la globopentaosa (Gb5, Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc); CTL4 también unió HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n y β1-3Glucan (Glcβ1-4Glc)n. Tres de los cinco glicanos reconocidos por el monómero CTLMA2 estaban sulfatados, y el heterodímero CTL4/CTLMA2 reconoció el condroitín sulfato y el condroitín-6 sulfato, el ácido hialurónico (GlcAβ1-4GlcNAcβ1-3)8 y la HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n. Estos resultados sugieren que hay efectos distintos y sinérgicos de la heterodimerización en la unión de glicanos.

Tanto CTLMA2 como el heterodímero CTL4/CTLMA2 reconocen varios azúcares que contienen fucosa, incluyendo sialil-LewisX y sulfo-LewisA pero no sialil-LewisA. La mayor afinidad de unión se observó con sulfo-LewisA con la unión al complejo CTLMA2 (106 nM) y CTL4/CTLMA2 (95 nM) a un KD de ~100 nM (Tabla 3). La unión de mayor afinidad observada para CTL4 fue también a un glicano sulfatado, la sulfo-lactosamina (292 nM).

Análisis estructural

Para seguir investigando la estructura de CTL4 y CTLMA2, generamos modelos estructurales de CTL4 y CTLMA2 (Fig. 4b) utilizando MODELLER29 con edición manual adicional. Tanto CTL4 como CTLMA2 tienen un bucle extendido (bucle 1) que sigue a la segunda hélice del CTLD (Fig. 4a) con una alta densidad de residuos cargados complementarios; residuos básicos para CTL4 y residuos ácidos para CTLMA2. La electrostática complementaria de estos residuos del bucle 1 y su proximidad al motivo CXCXC N-terminal sugieren que se trata de una potencial interfaz proteína/proteína dentro del heterodímero (Fig. 4b), para la que se generó un modelo hipotético con un único enlace disulfuro en el motivo CXCXC. Sin embargo, los bucles de unión del glicano/Ca2+ son una segunda interfaz potencial, como se observó para las dos cadenas de D. acutus X-bp. La hipótesis alternativa es que los dos dominios CTL son independientes entre sí, con enlazadores flexibles que los unen a través de la hipótesis intermolecular.

Para probar esta hipótesis, analizamos la estructura en solución de CTL4/CTLMA2 mediante dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS). Los experimentos se llevaron a cabo en NaCl 0,5 M, CHES 20 mM pH 9,0, CaCl2 0,5 mM y glicerol 1% para minimizar las interacciones entre partículas. En estas condiciones, la proteína mostró una relación lineal entre la intensidad extrapolada al ángulo cero y la concentración (I0 vs. c) hasta una concentración de 3,1 mg/ml. La curva extrapolada de intensidad I vs. q (Fig. 4c) se sometió a SAXSMoW2 que arroja un RG = 23,0 Å (I0 = 0,61) y un peso molecular MW = 39 kDa, sólo un 11% mayor que el MW del heterodímero esperado de 35 kDa30. Sin embargo, el gráfico de Guinier calculado se basa en sólo siete puntos de datos; el ajuste sobre un rango extendido (Fig. 4c, recuadro) arroja un RG = 24,5 Å (I0 = 0,64), mientras que el ajuste de la función de distribución por pares P(r) (Fig. 4d) arroja un RG = 25,4 Å (I0 = 0,65). La distribución P(r) ajustada por DAMMIF31 con 20 modelos de cuentas ab initio con una discrepancia estructural normalizada promedio NSD = 1,0 ± 0,2. El cuerpo principal de los modelos ab initio tiene una forma similar a la del heterodímero CTL4/CTLMA2 esperado.

Una densidad adicional se extiende desde el cuerpo principal de los modelos de perlas que puede reflejar o bien la secuencia N-terminal de ambas proteínas, incluyendo el motivo CXCXC, o bien una población menor de CTL4/CTLMA2 con un radio de giro mayor. Para probar esta hipótesis realizamos un modelado multiestado del perfil SAXS con el programa MULTIFOXS32. Generamos un modelo completo para CTL4-6xHis/CTLMA2 con un coiled-coil N-terminal terminado por un disulfuro intermolecular entre CTL4 C39 y CTLMA2 C34. MULTIFOXS generó un conjunto de 10.000 variantes del modelo para comparar con la curva de dispersión experimental. Los únicos residuos flexibles eran CTL4 40-45 y 178-183 (6xHis) y CTLMA2 35-39, con un serpentín N-terminal que servía de cuerpo rígido para conectar las dos cadenas. El mejor modelo de un estado se ajustó a los datos con χ2 = 1,13 y tenía RG = 23,7 Å. El mínimo χ2 = 1,07 se consiguió con un modelo de tres estados (Fig. 4e), en el que el 80% de la dispersión la aportan dos modelos compactos con RG = 22,0 Å y RG = 23,7 Å. Estos datos son consistentes con la formación de un heterodímero compacto entre CTL4 y CTLMA2.

CTL4/CTLMA2 inhiben la activación de la fenoloxidasa en respuesta a E. coli

CTL4 y CTLMA2 funcionan como inhibidores de la respuesta de melanización del mosquito a la infección. Anteriormente se informó de que el knockdown de CTL4 no condujo a un aumento de la actividad de la fenoloxidasa (PO) en respuesta a la infección con una mezcla de E. coli y S. aureus20. El mismo estudio, sin embargo, encontró que los mosquitos dsCTL4 y dsCTLMA2 eran específicamente susceptibles a las bacterias Gram-negativas. Por lo tanto, volvimos a examinar el efecto de la eliminación de CTL4 y CTLMA2 en la actividad de PO en la hemolinfa en respuesta a la infección por E. coli (Fig. 5a). A las 4 horas después de la infección con E. coli, la actividad de PO fue significativamente mayor para los mosquitos dsCTL4 (p = 0,02) y dsCTLMA2 (p = 0,004) en comparación con los controles dsLacZ (Fig. 5b). La eficiencia media de derribo para CTL4 y CTLMA2 fue de 93 ± 3% y 89 ± 3%, respectivamente, con >80% en cualquier experimento individual.

La melanización de los ookinetes de Plasmodium tras el silenciamiento de CTL4/CTLMA2 depende de LRIM117,22, TEP133 y SPCLIP133. Dado que todos estos son elementos de la respuesta inmune tipo complemento TEP1, razonamos que el aumento de la actividad PO en ausencia de CTL4 debería ser dependiente de TEP1. En consecuencia, comparamos el aumento de la actividad de PO en los mosquitos dsCTL4 con la coadministración de dsTEP1 con la coadministración de dsLacZ (Fig. 5c). La eficacia media del knockdown de TEP1 fue de 82 ± 9% y >80% en 5/6 experimentos (64% en un experimento). De hecho, no hubo una mejora significativa de la actividad PO en los mosquitos dsCTL4 cuando también se silenció TEP1. Esto confirma que la melanización en ausencia de CTL4/CTLMA2 es dependiente de TEP1.

La coadministración de CTL4/CTLMA2 recombinante con E. coli revirtió significativamente el aumento de la actividad PO en los mosquitos dsCTL4 en comparación con BSA (p = 0,007, Fig. 5d). Estos resultados demuestran que CTL4/CTLMA2 está directamente implicado como regulador negativo de la actividad PO. Sin embargo, en los mosquitos dsLacZ, CTL4/CTLMA2 no suprimió la actividad PO inducida por E. coli en comparación con la albúmina de suero bovino (BSA). Además, la actividad de PO inducida por E. coli en los mosquitos dsCTL4 coinyectados con CTL4/CTLMA2 recombinantes (dsCTL4 + CTLs) fue mayor que la de los mosquitos dsLacZ coinyectados con BSA (dsLacZ + BSA). Por lo tanto, la inyección de CTL4/CTLMA2 recombinante no rescata completamente la pérdida de la proteína endógena.