D-kompleksin muodostuminen
Protrombinaasin muodostuminen määrittelee katalyyttisesti tärkeän moduloivan tapahtuman, koska kokonainen kompleksi on 300 000 kertaa tehokkaampi kuin protetrombiiniin liuoksessa vaikuttava vapaa faktorin Xa.24,72 Tämän merkittävän nopeuslisäyksen seurauksena mikä tahansa kompleksin osien irtoaminen kompleksista vähentää entsyymin aktiviteettia merkittävästi ja voimakkaasti. Kalvopinnan puuttuminen täydellisestä katalysaattorista johtaa 1000-kertaiseen katalyyttisen tehokkuuden laskuun, kun taas tekijä Va:n poistaminen kompleksista johtaa 10 000-kertaiseen trombiinin muodostumisnopeuden laskuun.24 Kalvopinta on välttämätön, koska vaikka se vaikuttaa vain vähän katalyysin omaan nopeuteen, se tarjoaa ympäristön, jossa sekä tekijä Va-tekijä Xa-kompleksi että substraatti voivat keskittyä.277 Protrombiini näyttää keskittyvän verihiutaleiden kalvopinnalle suurelta osin aiemmin kuvattujen reseptorivälitteisten mekanismien avulla. Tekijä Va muodostaa kalvon sitoutumiskykynsä ansiosta pakollisen ja korkean affiniteetin vuorovaikutuksen tekijä Xa:n kanssa, koska tekijä Xa ei sitoudu aktivoituneisiin verihiutaleisiin ilman tekijä Va:ta. Reagenssien keskittyminen kalvon pinnalle johtaa reagenssien korkeisiin paikallisiin pitoisuuksiin, jotka ylittävät reaktion luontaisen Km-arvon ja parantavat merkittävästi katalyyttistä tehokkuutta. Lisäksi tekijä Va lisää reaktion liikevaihtonopeutta mekanismilla, jota ei ole vielä rationalisoitu.278
Kompleksinmuodostus antaa myös protrombinaasin rakenneosille suojan inhibiittoreilta ja/tai inaktivaattoreilta. Toisin kuin liuoksessa vapaana oleva tekijä Xa, protrombinaasiin sisällytetty tekijä Xa (eli kompleksoituneena kalvoon sitoutuneen tekijä Va:n kanssa) on suojattu antitrombiini III:n ja hepariinin aiheuttamalta inhibitiolta.72 Samoin protrombinaasiin sisällytetty tekijä Va on suojattu aktivoidun proteiini C:n109,110 aiheuttamalta proteolyyttiseltä inaktivoitumiselta – prosessia käsitellään yksityiskohtaisesti seuraavassa jaksossa.
Intrinsistä Xa:ta säätelevät erilaiset mekanismit, jotka muistuttavat niitä mekanismeja, jotka on havaittu protrombinaasilla. Kompleksin muodostuminen johtaa noin 2 × 107-kertaiseen katalyyttisen tehokkuuden lisääntymiseen.217 Faktoreiden VIIIa ja IXaβ sitoutuminen trombiini-aktivoituneisiin verihiutaleisiin pienentää Km:ää tekijä X:n aktivaatiolle 2500-kertaiseksi ja mahdollistaa tekijä VIIIa:n kcat-arvon kasvattamisen noin 7500-kertaiseksi. Antitrombiini III ei pysty estämään tekijä IXaβ:tä tekijä VIIIa:n ja verihiutaleiden läsnä ollessa.279 Tekijä Va:n tavoin tekijä VIIIa:n kompleksinmuodostus tekijä IXaβ:n kanssa moduloi sen aktiivisuutta. A2-alayksikön dissosiaatio heterotriimeeristä tekijä VIIIa:sta, joka johtaa kofaktorin aktiivisuuden täydelliseen häviämiseen, estyy, kun se assosioituu kalvon pinnalla olevan tekijä IXaβ:n kanssa280 , samoin kuin sen inaktivoituminen APC:n vaikutuksesta62,281 .
Koska fysiologisesti merkityksellinen trombiinin muodostuminen edellyttää ehdottomasti tekijä Va:ta, merkittävät vaihtelut protrombiinin aktivaatiossa voidaan saada aikaan proteolyyttisten, inaktivoivien muutosten kautta kofaktorissa, joita katalysoi aktivoitunut proteiini C. Proteolyysi ja inaktivaatio edellyttävät, että tekijä Va on verihiutaleeseen59,74 tai kalvoon sidottuna 282. Varhaiset tutkimukset osoittivat, että aktivoidun proteiini C:n inkubointi trombiiniaktivoitujen verihiutaleiden kanssa aiheutti samansuuntaisen vähenemisen tekijä Xa:n sitoutumisessa ja protrombiinin aktivoitumisessa, mikä viittaa siihen, että aktivoidun proteiini C:n suorittaman pilkkomisen jälkeen tekijä Va ei sido tekijä Xa:ta.283,284 Näin ollen tekijä Va:n aktivoituneen proteiini C:n katalysoimalla inaktivoitumisella on dramaattinen vaikutus trombiinin syntyyn.
Ihmisen verihiutaleet kykenevät edistämään ja moduloimaan plasmasta ja verihiutaleista peräisin olevan tekijä Va:n aktivoituneen proteiini C:n katalysoimaa inaktivoitumista, vaikkakaan nämä kaksi kofaktorivarastoa eivät ole ekvivalentteja substraatteja inaktivoitumisen suhteen. Ihmisen tekijä Va -molekyylin raskaassa ketjussa tarvitaan kolme halkaisua, jotta aktivoituneen proteiini C:n katalysoima inaktivointi olisi tehokasta: Arg506:n pilkkoutuminen, jota seuraavat Arg306:n ja Arg679:n pilkkoutumiset,282,285 Arg506:n pilkkoutuminen on nopeampaa ja edeltää kalvosta riippuvaista, inaktivoivaa pilkkoutumista Arg306:n kohdalla,282 Trombiinilla aktivoidun ihmisen verihiutaleen pinnalla on tärkeä rooli verihiutaleista peräisin olevan tekijä Va:n ja tekijä Va:n variaation eli tekijä VaLeidenin aktivoituneen proteiini C:n katalysoimassa aktivoituneessa tekijässä Va:n ja tekijä Va:n muunnoksessa.109,110 Tekijä VaLeiden syntyy trombiiniaktivoimalla tekijä VLeiden, muunnos, jossa Arg506 on korvattu glutamiinilla, mikä olennaisesti poistaa aktivoidun proteiini C:n pilkkoutumiskohdan positiosta 506.286 Näin ollen tämän mutaation suhteen homotsygoottiset (ja joissakin tapauksissa heterotsygoottiset) henkilöt kärsivät heikosta antikoagulanttivasteesta aktivoituneelle proteiini C:lle, ja heillä on suurentunut laskimotromboosin riski.287 .-289 Aktiivinen proteiini C inaktivoi normaalit ja mutanttiset verihiutaleiden kofaktorit lähes identtisellä nopeudella; molempien verihiutaleista peräisin olevien kofaktorien täydellistä inaktivaatiota ei kuitenkaan koskaan saavuteta109,110 , koska jopa 50 % alkuperäisestä aktiivisuudesta säilyy. Nämä tulokset ovat selvästi ristiriidassa sen kanssa, mitä on havaittu tutkimuksissa, joissa on tutkittu plasmasta peräisin olevien tekijä Va:n ja tekijä VaLeidenin aktivoidun proteiini C:n katalysoimaa inaktivaatiota synteettisissä fosfolipidivesiileissä.290-292 Näissä tutkimuksissa havaittiin aina kofaktorien täydellinen inaktivaatio, vaikka plasmasta peräisin oleva tekijä VaLeiden inaktivoituu huomattavasti hitaammin kuin normaali plasmasta peräisin oleva tekijä Va. Verihiutaletutkimuksissa sekä verihiutaleista peräisin olevan tekijä Va:n että tekijä VaLeidenin jäännösaktiivisuus on suurempi, kun inaktivoivana kalvopintana käytetään trombiinilla aktivoituja verihiutaleita, kun taas synteettisiä fosfolipidivesikkeleitä käytetään inaktivoivana pintana ja kun inaktivaatiopintana on lähes täydellinen inaktivoituminen.110 Aktivoidut verihiutaleet suojaavat siis verihiutaleista peräisin olevia kofaktoreita aktivoidun proteiini C:n katalysoimalta inaktivoitumiselta.109,110
Aktivoidut verihiutaleet suojaavat myös normaalia plasmasta peräisin olevaa tekijä Va:ta aktivoidun proteiini C:n aiheuttamalta inaktivoitumiselta hidastamalla pilkkoutumista Arg506:n kohdalla.110 Toisin kuin verihiutaleista peräisin oleva kofaktori, plasmasta peräisin oleva tekijä Va voidaan kuitenkin täysin inaktivoida aktivoidun proteiini C:n toimesta, mikä viittaa siihen, että nämä kaksi erilaista kofaktorivarastoa (plasma vs. verihiutaleet) ovat erilaisia substraatteja APC:lle.110 Nämä tutkimukset vahvistavat jälleen kerran sitoutumistapahtuman merkityksen protrombinaasiaktiivisuuden moduloinnissa. Ne osoittavat myös, että verihiutaleiden ja synteettiset fosfolipidikalvot eivät ole vastaavia pintoja entsyymikompleksin muodostumisen säätelyssä. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että verihiutaleet ylläpitävät prokoagulanttitapahtumia tarjoamalla kalvopinnan, joka viivästyttää kofaktorin inaktivoitumista, ja vapauttamalla kofaktorimolekyylin, jolla on aktivoitunutta proteiini C:tä vastustuskykyinen fenotyyppi.
On mielenkiintoista pohtia, että valtimovauriokohdissa tekijä VLeidenin mutaatio ei ehkä ennusta yhtä helposti valtimotromboosia, koska normaalit ja varianttiset verihiutaleiden synnyttämät kofaktorimolekyylit vastustavat aktivoitunutta proteiini C:tä aktivoitunutta pintaa yhtä hyvin aktivoitunutta proteiini C:tä kohtaan. Itse asiassa tekijä VLeiden -mutaation osoitettu merkitys laskimotromboosin ennustamisessa287-289 saattaa heijastaa plasmasta peräisin olevan tekijä VaLeiden -kofaktorin dokumentoitua resistenssiä verrattuna normaaliin, plasmasta peräisin olevaan tekijä Va:han.290-292 Plasman kofaktorivarastolla saattaa olla merkittävämpi rooli laskimotromboosissa, koska verihiutaleiden osuus ei ole merkittävä. Sitä vastoin valtimotrombin kohdalla verihiutaleista peräisin olevan kofaktorin pitoisuus voi vapautumisensa ja aktivoitumisensa seurauksena olla yli 600-kertainen verrattuna plasman kofaktoriin.106
.