A hisztidin-protonáció és a rotamer állapotok receptorok prediktív teljesítményére gyakorolt hatásának értékelése érdekében virtuális szűrést (VS) végeztünk az Mtb RmlC enzimre egy korábbi nagy áteresztőképességű szűrési (HTS) vizsgálat eredményei alapján. Az alábbiakban először a TRH ko-kristályos ligandum tipikus kölcsönhatásait vizsgáljuk, hogy megvizsgáljuk a ligandum póz függését a hisztidin protonálódástól. Továbbá kontextusba helyezzük a különböző receptormodellek dúsítási teljesítményének és prediktív teljesítményének elemzését a receptorral való kölcsönhatások megvitatásával, hogy bemutassuk a különböző hisztidin-protonálási állapotok hatását a VS-re. Végül összehasonlítjuk a több elterjedt pKa-számítási csomag által számított prediktált pKa-értékeket a legjobb prediktív erővel rendelkező receptor-protonálási állapotokkal.
Docking of TRH
A TRH ko-kristályos ligandum visszadokkolását 36 receptormodellbe végeztük el, hogy megmutassuk a póz, vagyis a ligandum receptorhoz viszonyított orientációja függését a hisztidin-protonálástól és a rotamer állapotoktól. A 2b. ábrán látható, a His62 és His119 kristálykoordinátákhoz tartozó, kémiailag intuitív hidrogénkötési mintázatok a hidrogénkötések potenciális jelentőségére utalnak a TRH dokkolásában. Ennek a ligandumnak a dokkolása lehetővé tette a póznak a receptorral való lehetséges hidrogénkötés-hálózatoktól való függésének előzetes vizsgálatát.
A hisztidin protonáltsági állapotok változása egyértelmű hatással van a meghatározott ko-kristályos ligandum póz-előrejelzésére. Az öndokkolt TRH dokkolási pózának RMSD-je a kristálykoordinátákhoz a His62 és His119 különböző protonálási és rotamer állapotaihoz 2,91 és 5,44 Å között változott. A legjobb átlagos RMSD-vel rendelkező protonálási állapot mindkét hisztidin esetében a HIE, amely megegyezik a TRH kristálykoordinátáinak legvalószínűbb protonálási állapotával. Emellett a dokkoló algoritmus minden esetben helyesen jósolja meg a ligandum pirofoszfátjának helyzetét, de a kristálykoordinátáktól való nagy eltérés elsősorban a timidin- és a ramnózrészek pirofoszfát körüli átfordulásából ered, ami a TRH és a két hisztidin közötti eltérő hidrogénkötési mintázatot eredményez. Ez jelzi a His62 és His119 hidrogénkötés-hálózatok fontosságát a TRH ko-kristályos ligandum pózának előrejelzésében. Ezért, miután megvizsgáltuk a két hisztidin által biztosított hidrogénkötésektől való pózfüggést, kiterjesztettük a vizsgálatunkat, hogy szisztematikusan megvizsgáljuk a VS-ben a vegyületek rangsorolását, és azt, hogy hogyan befolyásolja azt a hisztidinek protonáltsága és rotamer állapota.
Virtuális szűrés
Molekuláris dokkolást végeztünk a vegyületek rangsorolásának a hisztidin protonáltságától és rotamer állapotától való függésének vizsgálatára. A ligandumkészlet tíz aktív és 2000 inaktív hatóanyagot tartalmazott, amelyeket véletlenszerűen választottak ki egy HTS-ből. Megjegyezzük, hogy a Tanimoto-pontszámok azt jelzik, hogy a legtöbb csalogányunk alacsony hasonlóságot mutat az aktívakkal. Egy ilyen csalétekhalmaz kisebb kihívást jelent a dokkoló algoritmus számára, és maga a VS prediktív teljesítménye is romolhat, ha az aktívakhoz nagyobb hasonlóságú csalétek kerülnek felhasználásra. Ennek a tanulmánynak azonban nem önmagában a dokkoló algoritmus prediktív teljesítményének vizsgálata volt a célja, hanem az, hogy a hisztidin protonáltsági állapotok hogyan befolyásolják a VS relatív teljesítményét.
A dokkolt aktív ligandumokat és a termékanalógot kezdetben az RmlC kötőhelyen lévő fontos kölcsönhatások jellemzésére vizsgáltuk. Minden receptormodellben a hidrofób pi-pi stacking kölcsönhatások jelentősen hozzájárulnak az aktív vegyületek dokkolási pontszámához az RmlC aktív helyén belül. A HTS-ből származó kezdeti találat vegyület, a SID7975595 a legtöbb receptormodellben magasan helyezkedik el, a 8. és 51. hely között a 36 receptorból 26-ban. Bár csak korlátozott szerkezeti hasonlóság van a SID7975595 és a ko-kristályos TRH ligandum között, a SID7975595 triciklusos gyűrűje könnyen helyettesíti a TRH timidin-részét, míg a benzimidazolon gyűrű a ramnóz-részt, ami a gátlás szerkezeti alapját biztosítja. Amint a 3. ábrán látható, az aktív hatóanyag és a receptor közötti hidrofób kölcsönhatásban gyakran az A láncból a Tyr132 és Tyr138, valamint a B láncból a Phe26 szerepel (megjegyzendő, hogy a B lánc egy része behatol az A lánc aktív centrumába). Azáltal, hogy kölcsönhatásba lépnek az alapvető kötőhelyi maradékokkal, és megakadályozzák, hogy a vízmolekulák hozzáférjenek a Phe26-hoz és a Tyr132-hez, az aktív hatóanyagok bőséges hidrofób kapcsolatot biztosítanak a magas kötési affinitás eléréséhez. A Sivendran és munkatársai által tárgyaltak szerint a SID7975595 triciklikus gyűrűjének nitrogénjéhez kapcsolódó etilcsoport allylcsoporttal való helyettesítése (pl. a 77074 hatóanyag) tovább növeli a kötési affinitást azáltal, hogy még szorosabb hidrofób tömítést képez. Ehhez képest e csoport kisebb metilcsoporttal vagy hidrogénatommal történő helyettesítése alacsonyabb kötési affinitást eredményez . A fent leírt hidrofób kapcsolatokon kívül néhány hatóanyag hidrogénkötést is kialakít a Ser51, Arg59 és Arg170-vel. A dokkolt hatóanyagok kölcsönhatásait leíró ábra a 3. online forrásban található.
A SID7975595 kezdeti találat vegyületének előre jelzett kölcsönhatása a 23. receptormodellben megfordított HID62-vel és HIP119-cel. Általában a hatóanyagok nem mutatnak erős kölcsönhatást a His62-vel vagy a His119-cel, ugyanakkor a különböző hisztidin-protonáltsági állapotok mélyreható hatással vannak a rangsorolt eredményekre. Kedvező kölcsönhatások figyelhetők meg más kötőhelyi maradékokkal, például a Tyr132-vel és a Tyr138-cal, ahogyan az itt
Érdekes, hogy az aktív hatóanyagok általában nem érnek el poláris kölcsönhatásokat a His62-vel és a His119-cel. Amint a 3. ábrán látható, a SID7975595 karbonil oxigénje és két benzimidazolon nitrogénje a His62 és His119-től elfelé néz. A hatóanyagok aromás hidrogénjeinek iránya gyakran nem képes részt venni a hidrogénkötéses hálózatokban a két hisztidinnel. Mindazonáltal e hisztidinek eltérő protonálódási és rotamer állapotai a csalétekanyagokkal való kölcsönhatásaikon keresztül befolyásolják a VS-eredményeket.
A rangsorbeli különbségek értékelése
A korlátozott erőforrások miatt nem ritka, hogy egy VS-vizsgálatban csak a szűrt vegyületek legjobb 1%-át lehet kísérletileg tesztelni. Ezért a VS prediktív hatásának értékelésében különösen fontos szerepet kap a dúsítási tényező (EF)1%-os metrika, amely az adatbázis dúsítási teljesítményét tükrözi egy könyvtár felső 1 %-ában (20 dokkolt vegyület). Az EF1% 0 és 80 között mozog 36 receptormodell esetében (1. táblázat), ami azt jelzi, hogy a VS eredményei érzékenyek az RmlC His62 és His119 protonálódási és rotamer állapotára. Mindazonáltal a 36 receptorból 28 receptor több mint nyolc hatóanyagot sorol a VS első 10 %-ába, amint azt az EF10% is tükrözi (1. táblázat), ami arra utal, hogy a legtöbb receptor képes megkülönböztetni az hatóanyagokat és a csalikat, ha az adatbázis nagyobb részét (10 %) vesszük figyelembe. Az EF eredmények arra is utalnak, hogy a HIP62-t vagy HIP119-et tartalmazó receptormodellek általában gyenge dúsítási teljesítményt nyújtanak, valószínűleg a csalétekhez kapcsolódó kiterjedt hidrogénkötési hálózatok miatt, amint azt később tárgyaljuk.
A vevői működési jelleggörbe alatti területet (AUC) minden receptormodell esetében kiértékeltük, hogy a His62 és His119 különböző protonálási és rotamer állapotainál a modellek dúsítási teljesítményét jelentse. Amint az a 4a. ábrán és az 1. táblázatban látható, az összes receptormodell AUC-értékei 0,868 és 0,996 között mozognak, ami összességében jó prediktív teljesítményt jelez (a 0,5-es AUC megfelel annak, hogy nincs különbség az aktív és a csalétek között). Általánosságban elmondható, hogy az AUC eredmény kiegészíti a receptorok előrejelző teljesítményének EF értékelését. Az 1. táblázatot összefoglalva a 4c. ábra mutatja, hogy a receptor teljesítményének tartománya hogyan függ a két hisztidin protonálási és rotamer állapottól. Az AUC-értékek 25-75 %-os tartományát figyelembe véve (4c. ábra, vastagabb vonalakkal jelölve), a His62 modellek nagyobb eltérést mutatnak a His119 állapotok között. A His119 modellek ezzel szemben a His62 protonálódási állapottól függetlenül konzisztensebb teljesítményt mutatnak, a HIP állapot kivételével. Ez azt jelzi, hogy a His62 különböző protonációs állapotai kisebb hatással vannak a receptor teljesítményére, mint a His119-é.
a 36 receptormodell AUC-értékei. A protonálódási és rotamer állapotok minden hisztidin esetében jelölve vannak. A megfordított állapotokat F betűvel jelöljük. A sötétebb szín magasabb AUC-értéket és a megfelelő receptormodell jobb prediktív teljesítményét jelzi. b A 36 VS-futtatásban a legjobb 1 % vegyületek átlagos hidrogénkötési százalékos aránya. A protonálódási és rotamer állapotok minden egyes hisztidin esetében jelölve vannak. A világosabb szín magasabb hidrogénkötés százalékos arányt jelez, a színsáv % egységgel. Az AUC és az átlagos hidrogénkötés százalékos aránya közötti korreláció R2 értéke az egyes VS-futtatások esetében 0,42 (a szórásdiagramot lásd a 4. online forrásban). c A receptor teljesítményének függése a His62-től (fent) és a His119-től (lent). Az egyes protonáltsági állapotok AUC-értékeinek mediánját nagy vízszintes vonal mutatja. A kis pipacsok az egyes hisztidinmodellekben a másik hisztidin hat különböző protonálódási állapotát jelölik. A vastagabb függőleges vonalak az AUC-értékek 25-75 %-os tartományát jelölik. A legjobb receptormodelleket kifejezetten a modellek protonálódási állapotaival
A HIE62 és HIP62 modellekben a His119 protonálódási állapotaitól való erősebb dúsulásfüggés figyelhető meg. A HIE62 állapot esetén az átfordított HIP119 (6. modell) és az átfordított HIE119 (2. modell) modellek adják a legmagasabb receptorteljesítményt. A 3. és az 5. modell HID119-cel, illetve HIP119-cel a legrosszabb feldúsulást eredményezi. Ha azt vizsgáljuk, hogy miért a HIE62 állapotnak van a legnagyobb AUC-változása, azt találjuk, hogy a His62-nek vagy pi-pi stacking vagy semmilyen kölcsönhatása nincs a ligandumokkal, és csak néhány hidrogénkötést hoz létre a magas rangú csalogányokkal. Ezért a receptor teljesítménye a His119 és a csalétek kölcsönhatásától függ. Ez látható a HIP62 modellek AUC-értékeinek széles teljesítménytartományát vizsgálva is. A csalétekhez kapcsolódó hidrogénkötés-hálózatokat a későbbiekben tárgyaljuk.
A receptormodell-pár AUC-értékei közötti különbség statisztikai szignifikanciájának értékeléséhez 95%-os szinten kétoldalas p-tesztet végeztünk arra a nullhipotézisre, hogy a pár statisztikailag hasonló AUC-értékekkel rendelkezik, azzal az alternatív hipotézissel szemben, hogy az AUC-értékek és a prediktív teljesítményük közötti különbségük statisztikailag jelentős. Az eredményt az 1. online erőforrástáblázat mutatja be, a 0,05-nél kisebb p-értékeket kiemelve. A receptorok átlagosan több mint 16 db 0,05-nél kisebb p-értékkel rendelkeznek, ami a VS érzékenységét mutatja a hisztidin-protonációra és a rotamer állapotokra. Amint az várható volt, a legszignifikánsabb különbségeket mutató receptorok megfelelnek a legmagasabb (6. modell) vagy legalacsonyabb AUC-értékkel rendelkező modelleknek (3., 29. és 5. modell). A 6. modell statisztikailag jobban rangsorolja az aktív hatóanyagokat a csalétekhez képest, mint az együttes 26 másik receptora. A 3., 29. és 5. modell megkülönböztethetően rosszabbul rangsorolja az aktív hatóanyagokat, mint 29, 25, illetve 31 másik receptor.
A hidrogénkötési kölcsönhatások kvantitatív elemzését minden VS eredmény felső 1 %-ának (20 dokkolt vegyület) esetében elvégeztük, hogy figyelembe vegyük a kötőhelyi maradékokkal a csaléteknél gyakran megfigyelt bőséges hidrogénkötési kölcsönhatásokat. Az eredmények inverz korrelációt mutatnak a hidrogénkötés hozzájárulása és a receptor teljesítménye között. A 4b. ábra mutatja az egyes receptormodellek átlagos hidrogénkötési százalékos arányát a legjobb 1 % dokkolt vegyületek esetében. A hidrogénkötés százalékos aránya a Glide XP hidrogénkötés kifejezés részaránya a teljes dokkolási pontszámban. A 4a. és b. ábra összehasonlítása a hidrogénkötés százalékos aránya és az AUC közötti fordított kapcsolatot mutatja, az R2 értéke 0,42 (y = -56,18x + 67,95, a korrelációt a 4. online forrásban ábrázoltuk). Az inverz kapcsolat általában a HIP119, a megfordított HIP119 vagy a HID62 modelleknél figyelhető meg, ahol a magas hidrogénkötés százalékos aránya gyenge feldúsulást eredményezett. Például a 29-es receptormodell HIP62-vel és HIP119-cel, ahol mindkét hisztidin aktív hely felé néző hidrogénkötés-donort jelent, az egyik legrosszabb AUC-értékkel rendelkezik, a hidrogénkötések magas százalékos aránya miatt a top találatokban.
A His119 hidrogénkötési potenciálja gyakran meghatározza a receptor teljesítményét. Például a HID62-t és HIP119-et tartalmazó modell a 4c. ábrán látható HID62 modellek között kiugrónak számít, feltűnően alacsony dúsulással a másik öt HID62 modell általános jó teljesítményéhez képest. A HID62 modellek magas, 0,989-es medián AUC értékkel rendelkeznek, annak ellenére, hogy a HID62-ről származó csalétekhez gyakran hidrogénkötés kapcsolódik. Ez annak köszönhető, hogy a His119 állapotok kevés hidrogénkötési kölcsönhatást érnek el a csalétkekkel. A HID62 modell csak a HIP119 állapottal létesít hidrogénkötéseket számos csalival, ami a viszonylag alacsony AUC-t eredményezi. Ez a megfigyelés összhangban van a receptor teljesítményének a His119 protonálódási állapotaitól való erősebb függésével, amint azt fentebb tárgyaltuk. A 4. online erőforrás leírja az AUC-eloszlást és a hidrogénkötés százalékos arányát a receptorral szemben álló két hisztidin hidrogénkötés-donor vagy -akceptor irányával együtt.
A fenti elemzések rávilágítanak a csalétekhez való hidrogénkötésnek a VS prediktív teljesítményét akadályozó hatására, ami a két eltérő protonálódási és rotamer állapotú hisztidin különböző koordinátáinak köszönhető. A megfigyelt korreláció szórása a 0,42-es R2 értékkel valószínűleg több okra vezethető vissza, beleértve a csalétek adathalmaz kémiai jellegét, valamint az egyes receptorok geometriájának enyhe eltéréseit a fehérje kezdeti előkészítése során végzett minimalizáláskor. A virtuális szűrési eredményeknek az aktív centrumban lévő hisztidinek különböző protonálódási és rotamer állapotaira való érzékenységének egyértelmű bemutatásával hangsúlyozzuk, hogy a receptorok VS-hez való atomkoordinátáinak előkészítésekor körültekintően kell eljárni, különösen a szűrendő ligandumok általános tulajdonságait figyelembe véve. Ez magában foglalja a ko-kristályos ligandumhoz való hidrogénkötés és annak a fehérjekészítésre gyakorolt hatásának figyelembevételét, valamint a proximális hidrogénkötési hálózatok átfogó elemzését. Ez általában a széles körben használt pKa-előrejelző szoftvercsomagok eredményeinek vizsgálatával érhető el, és eddig a pontig összehasonlítottuk a különböző csomagok eredményeit a VS-eredményeinkhez viszonyítva, és tovább tárgyaljuk őket.
A csalétek dokkolása
Változatos tényezők vezetnek a receptorok közötti rangsorbeli különbségekhez, különösen a csalétek tekintetében. Általánosságban elmondható, hogy az aktív hatóanyagoknál magasabbra rangsorolt csalétekanyagok nagy molekulatömegűek voltak, és több lehetőségük volt hidrogénkötést létesíteni a receptorral. Ebben a szakaszban tovább elemezzük a csalétek és a receptor között megfigyelt gyakori kölcsönhatási mintázatokat, különös tekintettel a rosszul feldúsult receptormodellekre.
A csalétek általában nagyobb molekulatömegűek és több gyűrűs szerkezetűek, mint az aktívak (2. táblázat). Ez azt eredményezi, hogy a receptorral való hidrogénkötések hiányában a hidrofób kölcsönhatások miatt a csalétek magasabb rangsorolást kapnak. Az 5a. ábra a 19-es receptormodellben a 16952387 nagyméretű inaktív vegyület által elért hidrofób kölcsönhatásokat mutatja. Ez a vegyület sok VS-futtatásban gyakran az első öt között szerepel a Phe26-tal, Tyr132-vel és Tyr138-cal való jelentős pi-pi stacking kölcsönhatásai miatt. Ez a tendencia gyakran megfigyelhető a virtuális szűrés során, ahol a nagyobb molekulák a receptorral való kiterjedt kölcsönhatások eredményeként jobb helyezést érnek el.
a A 16952387 inaktív vegyület kölcsönhatása a 19-es receptormodellben megfordított HID62-vel és HIE119-cel. A vegyületnek nincs kölcsönhatása egyik hisztidinnel sem. A B lánc Phe26-jával, a Tyr132-vel és a Tyr138-cal kialakuló Pi-pi stacking kölcsönhatások járulnak hozzá a magas rangjához, valamint az Arg23-mal, Arg59-nel, Arg170-nel és Ser51-gyel kialakuló hidrogénkötések (nem látható). b Az inaktív 17388064 vegyület kölcsönhatása a HIE62-vel és a HID119-cel a 3. receptormodellben. Mindkét hisztidin hidrogénkötést biztosít a vegyülethez
A dúsítási teljesítmény különösen alacsony a csalétekhez bőséges hidrogénkötési hálózatokat biztosító receptorok esetében. A His62-n és His119-en keresztüli kölcsönhatások nem voltak széles körben megfigyelhetők az aktívumok esetében, ezért a nagyobb entalpiás hozzájárulásokkal rendelkező vegyületek tévesen kedvezőbb helyezést érnek el. Az 5b. ábrán látható példa a 17388064 inaktív vegyület kölcsönhatását ábrázolja a 3. receptormodellben (AUC 0,868), amely az első helyre került. Ebben a receptorban, amely a legrosszabbul rangsorolja a vegyületeket az AUC alapján, a 17388064 vegyület két hidrogénkötést képez két hisztidinnel, az egyiket a hidroxil-hidrogénje és a HIE62 δ-nitrogénje között, a másikat pedig a hidroxil-oxigénje és a HID119 δ-nitrogénjének hidrogénje között. Ennek a vegyületnek öt hidrogénkötés-donorja és kilenc akceptora van, ami nagy szám a csalétek és az aktív vegyületek átlagához képest (2. táblázat). Ezért a hidrogénkötés 34,7 ± 6,62%-os, az összpontszámhoz való magas hidrogénkötési hozzájárulásával ez a csalétekvegyület gyakran megfigyelhető, hogy legalább egy hidrogénkötést képez a két hisztidin valamelyikével, ezáltal magas helyezéseket ér el több VS-futtatásban.
Két másik receptormodell, a 29-es modell a HIP62 és HIP119, valamint az 5-ös modell a HIE62 és HIP119 segítségével, a csalétekhez hasonló kölcsönhatási mintázatot mutat, mint a 3. modell. E három modellnek van a legalacsonyabb AUC-értéke, átlagosan 0,870 közöttük. Amint azt fentebb tárgyaltuk, AUC-értékeik jelentősen eltérnek a többi receptortól, ami a His62 és His119 révén elért hidrogénkötések és a gyenge dúsulás közötti finom kapcsolatot tükrözi. A csalétek és a receptorok közötti hidrogénkötés-hálózatokat leíró további ábra az 5. online forrásban található.
pKa előrejelzés a His62 és His119 számára
Eredményeink egyértelműen bizonyítják a virtuális szűrés érzékenységét a hisztidin-protonálódásra és a rotamer állapotokra. Számos számításos biofizikai vizsgálatban a titrálható maradékok protonálódási állapotait különböző pKa-előrejelző programok segítségével határozzák meg. Annak felmérésére, hogy ezek a programok milyen teljesítményt nyújtanak a dokkolásban legjobb prediktív erővel rendelkező receptormodell azonosítására, összehasonlítottuk a PROPKA, Maestro, H++ és MCCE programokban a His62 és His119 pKa predikciós eredményeit a 3. táblázatban látható módon a számított pKa értékekkel.
Először is, a PROPKA 3.1 azt jósolja, hogy mind a His62, mind a His119 semleges, függetlenül a TRH jelenlététől a preparálás során. A program azonban nem tudja hozzárendelni a hisztidinek rotamer állapotát. Ezért a HID, flipped HID, HIE vagy flipped HIE állapotot kézzel kell meghatározni. A PROPKA-hoz hasonlóan az egyszerkezetű kontinuum-elektrosztatikát használó H++ program is semlegesnek találja mindkét hisztidint, bár az előre jelzett pKa értékek eltérnek a PROPKA-tól. Az MCCE program, amely többkonformációs kontinuum-elektrosztatikán alapul, a His62-t semlegesnek, míg a His119-et protonáltnak jósolja.
A következőkben a Maestro Protein Preparation Wizard programmal kiszámítottuk a His62 és a His119 pKa értékét TRH-val és anélkül. Megjegyzendő, hogy a Maestro képes a rotamer állapotok variálására, míg a PROPKA nem. Egy nemrégiben készült frissítés lehetővé teszi, hogy a Maestro az Epik helyett a PROPKA-t használja a pKa előrejelzésében. Az Epik segítségével a Maestro mind a His62-t, mind a His119-et kétszeresen protonált állapotban jelzi előre, függetlenül a TRH jelenlététől. Érdekes módon az ennek a többszörös hisztidin állapotnak megfelelő receptormodell rendelkezik a legrosszabb előrejelző képességgel, 0,869-es AUC értékkel. A PROPKA használata esetén a HIP62 és a HIE119 a fehérje-TRH komplexhez, a HIE62 és a HIE119 pedig az apo fehérjéhez jósolható. Ez a két PROPKA által a Maestro-ban készített predikció megfelel a mérsékelt dúsítási teljesítményű modelleknek, a 25. modell (HIP62 és HIE119) esetében 0,971-es, az 1. modell (HIE62 és HIE119) esetében pedig 0,942-es AUC-értékkel.
Mivel a különböző szoftverek által készített fenti predikciók jelentősen eltérnek egymástól, óvatosan kell eljárni, amikor ezeket az eredményeket iránymutatásként használjuk egy fehérje virtuális szűrésre való előkészítéséhez. A receptor valódi protonáltsági állapotának, valamint a szűrendő ligandumok bensőséges ismerete nélkül nehéz kezelni ezt a problémát. Ezért azt javasoljuk, hogy a fehérje receptorok titrálható maradékai protonálódási és rotamer állapotának pontosabb leírását a jövőbeni nagyobb léptékű szűrésekhez egy, a jelen tanulmányban elvégzetthez hasonló kisléptékű elemzés és a kísérleti adatokkal való összehasonlítás – amennyiben rendelkezésre állnak – biztosíthatná. Alternatív megoldásként érdemes lehet egy olyan modell, amely a dokkolás során explicit módon tartalmazza az alternatív oldallánc-protonálódási és rotamer állapotokat, esetleg a rácsban tárolt információval, ahogyan az a Glide-ban a forgatható hidroxilok és tiolok esetében létezik. Az eredmények vizsgálatát a protonálódási állapotok és a hisztidinekkel való kölcsönhatásokon alapuló rangsorok tekintetében alaposan meg kell vizsgálni, mielőtt a kísérleti tesztelésre kerülne sor.
A receptor rugalmassága emellett valószínűleg hatással lesz az ionizálható maradékok protonálódási állapotaira. Bár ezt itt nem vizsgáltuk kifejezetten, az egyes receptorok protonáltsági állapotok hozzárendelése utáni minimalizálásától eltekintve a fehérje rugalmassága egyértelműen fontos a gyógyszertervezés és -fejlesztés szempontjából . A konformációs és protonációs tér együttes figyelembevétele az itt leírtakhoz hasonló fizikai módszerekkel gyorsan megoldhatatlanná válik, de a továbbfejlesztett mintavételi módszerek ígéretesnek mutatkoznak az ilyen nehézségek kezelésében . Ide tartoznak az állandó pH-jú molekuladinamikai szimulációk, amelyek esetében a pH egy külső termodinamikai változó, amelyet a titrálható maradékok pKa értékeinek vak előrejelzésére használnak . Az ilyen szimulációk eredményeinek hatékony alkalmazása a molekuláris tervezésben folyamatos érdeklődés tárgyát képezi. Az ilyen szimulációkból származó egyensúlyi együttesek a dokkolással együtt használhatók a relaxált komplex séma alkalmazásaként, ahol a virtuális szűrést különböző protonált szerkezetek együttesével végzik, a dúsítási eredmények javítása érdekében . A receptor rugalmasságának figyelembe vétele a célpont-előkészítés során a konformációs és protonációs tér szélesebb körű mintavételezéséhez vezet, így javítva a VS teljesítményét.