Az Aspergillus fajok laboratóriumi kimutatása és azonosítása mikroszkópos megfigyeléssel és tenyésztéssel: a hagyományos megközelítés

Abstract

A molekuláris és immunológiai tesztek az aspergillosis jobb és gyorsabb laboratóriumi diagnózisát ígérik, de a mikroszkópia és a tenyésztés továbbra is általánosan használt és alapvető eszköz. Az eljárási változtatások, valamint a laboratóriumi szakemberek megfelelő képzése növelheti e hagyományos eszközök értékét. A Blankophor vagy Calcofluor használata a mikroszkópos vizsgálatokhoz; az opportunista gombák morfológiai jellemzőinek jobb felismerése a minták festett keneteiben; az Aspergillus spp. növekedési sebességének és konídiumtermelésének maximalizálása tenyészetben; és a gyakori aspergillusok atipikus változatainak felismerése javíthatja a laboratórium hozzájárulását a gyors diagnózishoz. Felmérések szerint a laboratóriumi szakemberek száma csökken, miközben az egészségügyi ellátás iránti igény növekszik. A személyzet hatékony toborzásának, megtartásának és képzésének párhuzamosan kell történnie a technológia fejlődésével.

Bevezetés

Az aspergillózis és más mikózisok diagnózisának hagyományos módszereit molekuláris és immunológiai megközelítések egészítik ki. Bár a nukleinsav alapú tesztek előnyei nyilvánvalóak, szabványosításuk és klinikai hasznosságuk még nem valósult meg teljes mértékben . Továbbá, míg az Aspergillus antigénre vonatkozó galaktomannán EIA teszt széles körben elérhető az Egyesült Államokban, a nukleinsav-alapú tesztek standard használata a klinikai izolátumok azonosítására korlátozottnak tűnik. Az aspergillusok molekuláris azonosítását végző referencialaboratóriumok közé tartozik a Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Atlanta, Georgia, a Centraalbureau voor Schimmelcultur (CBS), Utrecht, Hollandia, valamint az Association for Molecular Pathology online tesztjegyzékében felsorolt amerikai laboratóriumok. Bár a molekuláris módszerek folyamatosan fejlődnek és egyre könnyebben hozzáférhetővé válnak, az aspergilli kimutatásának elsődleges laboratóriumi eszközei továbbra is a mikroszkópia és a tenyésztés maradnak. Az Amerikai Mikrobiológiai Társaság (ASM) 2003-as összehasonlító felmérése dokumentálta, hogy a mikológiai vizsgálatokat végző laboratóriumok 89%-a kultúrát, 16%-a szerológiát, és kevesebb mint 5%-a molekuláris teszteket használ. A jelentést tevő laboratóriumoknak csupán 3%-a alkalmaz “házi készítésű” molekuláris vizsgálatot a mikrobiális kórokozók kimutatására. Mivel továbbra is a mikroszkópiára és a tenyésztésre támaszkodnak, ezen módszerek diagnosztikai értékét az eljárások megváltoztatásával és a laboratóriumi személyzet megfelelő képzésével javítani kell.

Mikroszkópia

A mikroszkópos módszerek, mint például a nedves preparátum, a Gram-festés és a hagyományos szövettani vizsgálat, olyan nyomokat szolgáltatnak, amelyek Aspergillus spp. jelenlétére utalnak a szövetekben. A 10-20%-os kálium-hidroxiddal (KOH) kevert Blankophor vagy Calcofluor megfesti a gombák sejtfalát, és javítja a gombák kimutatását. Míg a kalcofluor lúgos pH-n kristályosodik, addig a Blankofluor nem, és akár egy évig is tárolható munkaoldatban. A szövettani festésekkel, valamint Gram-festéssel vagy nedves preparátumokkal kimutatott fenotípusos markerek értékes információt nyújtanak a klinikailag fontos gombákról, különösen tenyésztés hiányában (1. táblázat). A mikroszkópos leletek tenyésztéssel történő megerősítése azonban mindig kívánatos, és a legtöbb esetben, amikor opportunista penészgombákról van szó, elengedhetetlen a kórokozó végleges azonosításához. A vizuális nyomok jelenléte ellenére az aspergillák mikroszkópos azonosítása önmagában félrevezető lehet. Schell beszámol egy Aspergillus niger sinusitis esetéről, amelyben az A. niger konídiumait összetévesztették a Candida spp. élesztősejtjeivel, és az A. niger stipiumainak keresztmetszeteit összetévesztették egy zigomyceta széles hifáival. A klinikai patológus és a laboratóriumi mikológus közötti kommunikáció, aki rutinszerűen azonosítja a filamentózus gombákat tenyésztésből, javíthatja a szövettani vizsgálat diagnosztikus értékét.

A morfológiai jellemzők felismerése

Mivel az aspergillák a természetben mindenütt jelen vannak, gyakran szennyezhetik a mintákat és a táptalajokat. Következésképpen a tenyészetben növekvő Aspergillus spp. jelentőségének meghatározása gyakran kihívást jelent, ha a minta mikroszkópos vizsgálata negatív. A máj- és veseátültetett recipiensek Aspergillus izolátumainak felmérése során Brown és munkatársai azt találták, hogy kettőnél több kolónia jelenléte a tenyészetben és az egynél több helyen történő fertőzés jelentős fertőzést jelzett előre. Akut leukémiában szenvedő granulocitopéniás betegeknél az alsó légúti mintából származó egyetlen izolációt jelentősnek kell tekinteni . A laboratóriumi megfigyelések egyértelmű jelentése az orvosnak csökkentheti a diagnosztikai dilemmát. Például a “Háromból két lemezen összesen három Aspergillus fumigatus kolóniát izoláltak” kijelentés több információt nyújt, mint a “Ritka A. fumigatus izoláltak”.

A tenyésztés eredményeinek optimalizálása

A gyakori klinikai Aspergillus spp. izolátumok tenyésztésben történő izolálása és fenotípusos azonosítása általában gyors és egyszerű. A tenyésztést azonban gyakran lassúnak írják le, ami talán tévhiteket kelt az aspergillák kimutatására vonatkozó értékével kapcsolatban. Az A. fumigatus gyorsan növekszik. A jellegzetes velutinos, szürkéskék-zöld kolóniák és az egysejtű konídiumfejek 24-48 óra alatt fejlődnek ki mind a gombás táptalajon, mind a baktériumtenyésztéshez általában használt juhvér-agaron. Az invazív aszpergillózissal összefüggésbe hozható más aszpergillák, különösen az A. flavus, A. niger, A. nidulans és A. terreus növekedési sebessége hasonló az A. fumigatuséhoz, amikor a telepeket malátakivonat-agaron és Czapek élesztőagaron mérték, miután hét napig 25°C-on és 37°C-on inkubálták őket. Mivel egyes Aspergillus spp. gyógyszerrezisztenciája veszélyt jelent, nemcsak az A. fumigatus, hanem a ritkábban izolált fajok teljes azonosítása is indokolt. A laboratóriumi kutatóknak fel kell ismerniük az Aspergillus spp. atipikus izolátumait is. A közelmúltban jelentették az A. fumigatus rosszul sporuláló (fehér) törzseinek csökkent érzékenységét számos gombaellenes gyógyszerrel szemben. Ezek a fehér törzsek genetikai szekvenciája eltér a vad típusú A. fumigatus Freseniusétól, és az inkubációt követő 10-12 napig nem fejlesztik ki a tipikus kékeszöld konídiumfejeket. Egy másik kihívás a fehér penész, a Neosartorya fisheri, amely kezdetben ritkás, az A. fumigatuséhoz hasonló konídiumfejeket termel. A N. fisheri azonban később számos, kerek, vékonyfalú kleisztotéciumot fejleszt, ami egyszerűvé teszi az A. fumigatustól való megkülönböztetést. A konídiumfejek és a kleisztotéciumok gyors lokalizálásához praktikus a bonctávcső. Az A. fumigatus steril, fehér, gyorsan növekvő vagy glabrous, halmozott, lassan növekvő izolátumai előfordulhatnak, amelyek végleges azonosításához termotolerancia és exoantigén vizsgálat szükséges. Khan és munkatársai beszámoltak egy atipikus A. terreus, amelyet egy aspergillomás beteg alsó légúti mintáiból izoláltak. A kezdeti kolóniák narancssárga színűek voltak, és diffúz sárga pigmentet, valamint apró, egysejtű sejteket termeltek, amelyeket összetévesztettek a Scedosporium apiospermum konídiumaival. A kicsapódó antitestek és az A. terreus tipikus konídiumfejei, amelyek 10 hetes inkubáció után keletkeztek, megerősítették az azonosítást.

A tankönyvekben és az interneten elérhető képek és információk kiváló oktatási lehetőségeket kínálnak az Aspergillus spp. azonosításának megtanulásához. A gyakorlati tapasztalat azonban továbbra is a leghatékonyabb oktatási eszköz. A CDC, a National Laboratory Training Network (NLTN) és a CBS laboratóriumi workshopokat kínál. Ha a helyszíni utazás nem célszerű, a laboratóriumokat arra ösztönzik, hogy a házon belüli képzéshez használják az Aspergillus Reference Cultures (Aspergillus referencia kultúrák) című online oktatóanyagot. Az ott felsorolt referenciaorganizmusok megvásárolhatók a főbb tenyésztési gyűjteményekből.

A tenyésztési eljárás minden egyes lépésének elemzése az aspergillák jobb kinyeréséhez vezethet. A minták Sputolysinnel vagy más mucolytikus szerekkel történő cseppfolyósítása javasolt a köpet és az endoszkópos műtétből kinyert sinus anyag nyálkájában rekedt gombák visszanyerésére . A burgonyadextróz, burgonyapehely, malátakivonat, gátló penészgomba-agar vagy hasonló sporulációs agarok használata az Aspergillus spp. elsődleges izoláló közegeként felgyorsíthatja a növekedési sebességet és a konídiumok termelődését. Az antibakteriális szerek hozzáadása az izoláló táptalajokhoz segít csökkenteni az azonosításig eltelt időt azáltal, hogy gátolja a baktériumok túlszaporodását és csökkenti a szubkultúra szükségességét. A gombás táptalajok kezdeti inkubálása 35-37°C-on 30°C helyett vagy mellett felgyorsíthatja egyes aspergillák növekedését. Hasonlóképpen, a táptalajok napi ellenőrzése biztosítja a lehető legkorábbi felismerést. Tarrand mikroaerofil környezetben, 35 °C-on inkubálva a tenyészlemezeket, azt találta, hogy a kiválasztott, klinikailag fontos Aspergillus spp. 12-ből 12 táptalajkultúrából 12-ben növekedett. Ugyanezen organizmusok 25 °C-on, CO2 nélkül inkubált tenyészetei nem hoztak pozitív eredményt. További vizsgálatok hasznosak lennének a klinikailag fontos aspergillák kinyerése és gyors azonosítása szempontjából leghatékonyabb táptalajok és körülmények tisztázásában.

Az Aspergillus spp. konídiumfejei egy gyors Scotch-tape vagy tease mount segítségével általában azonosíthatók. Azonban, ha a sporuláció lassú vagy atipikus, szükséges lehet a tárgylemeztenyésztés. A legtöbb kórházi laboratórium gyors tempója a legegyszerűbb, bár nem feltétlenül a legkifinomultabb módszert diktálja a diatermesztés elvégzésére. Riddell klasszikus tárgylemezkultúra-módszerét más, kevésbé munkaigényes technikákkal egészítették ki . A gyors módszer egyszerűen az, hogy egy 18 × 18 mm-es fedőlemezt 45 fokos szögben belenyomunk egy spórás táptalajba, például burgonyapehely-agarba. Amikor a penész spórázik, a fedőlemezt óvatosan kivesszük az agarból, és egy csepp lakto-fenol-kék vagy lakto-fukszin mikroszkópos tárgylemezre helyezzük. Egy másik cseppet helyeznek a kis fedőlap tetejére, mielőtt a szerelést egy 22 × 22 mm-es fedőlappal fejezik be.

Munkaerő kérdései

Az aspergillózis gyors diagnózisa nemcsak a jobb módszertantól, hanem a megfelelő, jól képzett munkaerőtől is függ. A mikológiai praxisok felmérései határozottan több képzést javasolnak . Különös hangsúlyt kell fektetni a pontos azonosításra, a közvetlen vizsgálatra, a hordozók megfelelő használatára, a klinikai relevanciára és a költséghatékonyságra. A nem megfelelő személyi állomány azonban veszélyeztetheti mind a képzést, mind a klinikailag relevánsabb eljárások végrehajtását. Az ASM teljesítményértékelő felmérése az Egyesült Államok egyes mikrobiológiai laboratóriumaiban folyamatos munkaerőhiányt tárt fel. A hiány részben abból adódik, hogy az elmúlt 12 évben 53%-56%-kal csökkent a CLS-képzési programok száma. A mikrobiológiai laboratóriumokban ma dolgozó szakemberek 34 százaléka 50 évnél idősebb. Lesznek-e fiatalabb munkavállalók a helyükre, amikor ők nyugdíjba mennek? Míg a női munkaerő közel 80%-a 30 évnél fiatalabb, addig a mikrobiológiai laboratóriumokban dolgozó női munkavállalóknak csak 10%-a 30 évnél fiatalabb . Ezek az adatok arra utalnak, hogy a munkaerőhiány folytatódni fog, és esetleg súlyosbodni fog.

Következtetés

A mikózisok hagyományos és nem hagyományos diagnosztikai eljárásainak javítása egyidejűleg erőfeszítéseket igényel a megfelelő munkaerő biztosítására és a karrier mobilitás, a szakmai elismerés, a továbbképzési lehetőségek, a díjazás és más, a laboratóriumi tudományok iránti érdeklődés felkeltéséhez szükséges tényezők javítására.