Bakteriális ko-kultúra sejtszignál fordító és növekedésszabályozó modulokkal a kultúra autonóm módon szabályozott összetételéért

AI-1 jel által szabályozott sejtnövekedési sebesség

Először az E. coli sejtek növekedési sebességének szabályozását vizsgáltuk a ptsH, egy cukortranszportban részt vevő gén transzkripciós szabályozásán keresztül. A HPr (amelyet a ptsH kódol) széles körben ismert, mint a fehérjék (pl. E1, HPr, EII) sorozatának egyike, amely szekvenciálisan egy foszforilcsoportot visz át a foszfenolpiruvátról (PEP) a glükózra (vagy más PTS szénhidrátra)34. A HPr erősen konzervált37. Nemrégiben fedeztük fel, hogy a HPr kölcsönhatásba lép az AI-2 kinázzal, az LsrK-val, és befolyásolja az AI-2 felvételét35. Az AI-2 moduláló funkciót később az AI-2 érzékelő sejt megalkotásakor hasznosítottuk. Itt kimutattuk, hogy a ptsH mutáns törzsek lassabban nőnek, mint a vad típusú törzsek glükózt tartalmazó minimál táptalajon (1a. kiegészítő ábra). Amikor a ptsH-t egy IPTG-indukálható promóter alá helyeztük a ptsH mutánsban, a növekedési sebességet az IPTG hozzáadása alapján lehetett szabályozni (1b. kiegészítő ábra). Fontos, hogy kimutattuk, hogy a ptsH expressziójának indukálása a sejtek növekedési sebességének növekedését eredményezi. Ugyanilyen fontos, hogy ez a viselkedés független attól, hogy a táptalaj tartalmaz-e glükózt fő szénforrásként vagy sem (1c. kiegészítő ábra).

A koncepció ezen igazolása alapján a következőkben QS jel által vezérelt növekedési sebességet terveztünk. A vezérlő törzs létrehozásához a ptsH-t a pAHL-HPr plazmidon lévő AI-1 lasI QS promóter kontrollja alá helyeztük (2a. ábra) a PH04 ptsH mutáns törzsben. A plazmidon máshol a sejtek vizualizációjához szükséges dsRedExpress2-t és a lasI promóter aktiválásához szükséges LasR-t konstitutív T5 promóter alatt fejeztük ki. Az AI-1 hozzáadása a kontrollertörzshöz a sejtek növekedési sebességét a kiindulási növekedési sebesség 1,8-szorosára növelte dózisfüggő módon (2b. ábra). A mért fajlagos növekedési sebesség (az AI-1 hozzáadása után 1 és 4 óra között) szolgált alapul az AI-1 szintjén alapuló Monod-típusú növekedési sebesség modellhez (2c. ábra).

Az AI-1 modulálja az összetételt a kontroller sejtek ko-kultúráiban

Az AI-1 szabályozott kontroller sejteket ezután más törzsekkel ko-kultiváltuk annak ellenőrzésére, hogy az AI-1 hozzáadása megváltoztatta-e a ko-kultúra összetételét. A vörös fluoreszcens fehérjét expresszáló növekedésszabályozó sejteket (PH04 pAHL-ptsH) PH04 pCT6 vagy TOP10 pT5G7 törzzsel együtt termesztettük. A PH04 pCT6 hasonló alapszintű növekedési sebességgel rendelkezik, mint a PH04 pAHL-ptsH, míg a TOP10 pT5G jelentősen gyorsabban növekszik. A kultúrákat megközelítőleg azonos sejtsűrűséggel oltottuk be, és különböző AI-1 szintekkel egészítettük ki. 8 óra elteltével mintákat vettünk fluoreszcens mikroszkópiás elemzéshez, és az ImageJ segítségével számszerűsítettük. A várakozásoknak megfelelően, amikor a kontroller sejteket PH04-gyel tenyésztettük, a kontroller sejtek kultúrájának összetétele az AI-1 koncentráció növekedésével nőtt (3a. ábra). Hasonló tendencia volt megfigyelhető, amikor a sejteket TOP10-zel tenyésztették, a TOP10 gyorsabb növekedési sebessége ellenére (3b. ábra). Vagyis az AI-1 nélküli társkultúrákban a TOP10 társkultúrákban a kontroller sejtek frakciója valójában jelentősen csökkent a kezdeti ~0,5-ről ~0,09-re az ezt követő 8 óra alatt. Az AI-1 hozzáadása ellensúlyozta ezt a növekedési sebességbeli különbséget, és ugyanezen 8 órás időszak alatt a kontroller sejtek magasabb szintjét eredményezte. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a kultúrában lévő más törzsektől és azok növekedési sebességétől függetlenül az AI-1 (amely nem egy E. coli QS szignálmolekula) módosítja a mesterséges kontrollertörzs növekedési sebességét, és a változás elég gyorsan bekövetkezett ahhoz, hogy a kultúra összetételében megfigyelhető változás következzen be – még viszonylag rövid távú szakaszos körülmények között is (szemben az etetett szakaszos, ismételt szakaszos vagy folyamatos kultúrákkal).

A következő lépésben az AI-1 szabályozott szabályozó törzset olyan sejtekkel együtt tenyésztettük, amelyek indukált állapotban AI-1-et termelnek. A PH04 pSox-LasI-t és a PH04 pAHL-HPr-t együtt tenyésztettük. A pSox-LasI plazmid az AI-1-et szintetizáló lasI-t tartalmazza a piocianin indukálható soxS promóter alatt7. Ebben a kísérletben a kontrollertörzs jelet kap egy transzlációs törzstől, amely viszont AI-1-et termelt a piocianin hatására. Ily módon a ko-kultúra-szabályozási rendszer egy adott molekuláris jelre reagál. Itt az egyes kultúrákat megközelítőleg azonos kiindulási sűrűséggel oltották be, és a ko-kultúrákat vagy kitették piocianinnak, vagy nem. A kitett kultúrák 5 órán belül megnövekedett AI-1 termelést és ennek megfelelően megnövekedett PH04 pAHL-HPr összetételt mutattak (3c. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az alternatív törzsből termelt AI-1 módosíthatja a vezérlő törzs növekedési sebességét, és hogy ez a változáshoz szükséges időskálán történhet egy szakaszos folyamatban. Ezen túlmenően ez mutatja a felhasználó által szabályozott, egy molekula vagy induktor, ebben az esetben a piocianin felhasználó-specifikus alkalmazásán alapuló ko-kultúra lehetséges megvalósíthatóságát. Ezután a fordító törzset úgy alakítottuk ki, hogy a mindenütt jelenlévő AI-2 jelzőmolekulán alapuló, autonóm módon szabályozott ko-kultúrát hozzunk létre.

Az AI-2-t érzékelő fordító sejtek tervezése

Az AI-2-t érzékelő és AI-1-et termelő sejtvonalak létrehozásához olyan törzseket alakítottunk ki, amelyek az AI-2 lsr promóter aktiválásakor aktiválják az AI-1-et szintetizáló LasI expresszióját. Két plazmidrendszert használtunk a gyenge lsr-promóter25 expressziójának felerősítésére (4a. ábra). Röviden, az AI-2-t az LsrK foszforilálja, és a foszforilált AI-2 feloldja a promóter LsrR általi represszióját, növelve az lsr transzporter gének transzkripcióját és gyorsítva az AI-2 felvételét. Ugyanakkor az lsr promóter AI-2-közvetített aktiválása a T7 RNS-polimeráz transzkripcióját eredményezi a pCT6 plazmidról, majd a lasI transzkripcióját a pET-LasI plazmidról.

A rendszert először a CT104 E. coli gazdatörzsben építettük fel, amely egy luxS mutáns (pl. AI-2 termelésére képtelen). A CT104-ből hiányzik az lsrFG is, amely a foszforilált AI-2 jel lebontásáért felelős, ami növeli a sejt érzékenységét az AI-238-ra. Ellenőriztük, hogy ez a CT104 pCT6 pET-LasI sejtvonal AI-1-et termelt, amikor AI-2-t termelő BL21-ből származó kondicionált médiában (CM) tenyésztettük (2. kiegészítő ábra). A BL21-et különböző sejtsűrűségig növesztettük, a CM-et összegyűjtöttük, és a CT104 sejteket az összegyűjtött CM-ben növesztettük. Fontos, hogy a CT104 sejtek által termelt AI-1 korrelált az AI-2 termelő BL21 sejtek sűrűségével (2a. kiegészítő ábra). Azt is megvizsgáltuk, hogy az AI-2 termelő sejtek különböző frakcióit tartalmazó konzorciumokhoz hozzáadott fordítósejtek képesek-e a konzorcium összetételétől függően AI-1 jelet termelni. A CT104 sejteket különböző arányú BL21 (luxS+) és BL21 ΔluxS kultúrákhoz adtuk. 6 óra elteltével az AI-1 jel szintje az extracelluláris közegben jelezte a kultúra összetételét, amely viszont elsősorban a luxS+ sejtek kezdeti frakcióján alapul25 (2b. kiegészítő ábra).

A fenti kísérletek azt mutatták, hogy AI-2 termelő sejtekből AI-2-re válaszul AI-1-et termelő sejtvonalat lehet létrehozni. Ezeket a kísérleteket LB médiumban és nem glükózt tartalmazó médiumban végeztük. A glükóz jelenléte gátolja az AI-2 felvételét és az lsr promóter aktivitását39 , és a CT104 sejtek felhasználása potenciálisan glükóz nélküli médiumokra korlátozható (az AI-2 QS útvonalának sémáját lásd a 3. kiegészítő ábrán). Az AI-2 QS rendszer ismerete alapján megpróbáltunk olyan törzset létrehozni, amely képes az AI-2 felvételére és az lsr promóter aktiválására glükózt tartalmazó közegben. Így eredményeinket általánosabban lehetett alkalmazni. Korábban kimutattuk, hogy a HPr (amelyet a ptsH kódol) kölcsönhatásba lép az LsrK-val, gátolva az LsrK kináz aktivitását, és hogy a ptsH mutánsokról kimutatták, hogy glükózt tartalmazó közegben is felveszik az AI-2-t35 . Ezért feltételeztük, hogy a PH04 (ΔptsH ΔluxS) gazdatörzsként való használata lehetővé teszi az AI-1 AI-2 alapú előállítását glükózt tartalmazó táptalajon. A fordítósejteket mindkét gazdatörzset használva LB és M9 glükózos táptalajon teszteltük AI-2-vel és anélkül. A termelt AI-1 mennyisége függött az AI-2 hozzáadásától, de a gazdatörzstől és a táptalajtól is (4b. ábra). Mindkét törzs termelt AI-1-et, amikor a sejteket AI-2-t tartalmazó LB táptalajhoz adtuk. A várakozásoknak megfelelően M9 táptalajon a CT104 gazdatörzs használata az AI-2-t tartalmazó és az AI-2 nélküli tenyészetek összehasonlításakor az AI-1 aktivitás kis vagy jelentéktelen alkalommal történő változását eredményezte. Fontos azonban, hogy a PH04 fordítósejtek M9 + glükóz táptalajon AI-2 aktivált AI-1 termelést mutattak. Így a módosított rendszer glükóztartalmú közegben is használható volt.

PH04 fordítósejtek jellemzése

A PH04 fordítósejtek felveszik az AI-2 szignálmolekulát, a LasI expressziójának aktiválásával továbbítják a jelet, valamint AI-1-et szintetizálnak és szekretálnak. A kívánt AI-1 kimenet ezután az AI-2 bemenet függvénye. Jellemeztük az AI-2 által jelzett AI-1 termelést a PH04 fordító törzsben az idő múlásával és a biológiailag releváns AI-2 koncentrációk tartományában. Megállapítottuk, hogy a PH04 fordítósejtek AI-1-termelésének mértéke dózisfüggő az AI-2-től (5a. ábra). Megjegyezzük, hogy ilyen és hasonló körülmények között az AI-2 nagyrészt 4 órán belül elfogy (5b. ábra). AI-2 vagy AI-2 alapú AI-1 termelés hozzáadása ezekben a szakaszos tenyészetekben nem eredményezte a sejtnövekedés megfigyelhető csökkenését (5c. ábra). Ezt követően jellemeztük az AI-1 termelésének sebességét az egyes vizsgált AI-2 koncentrációk esetében a sejtenkénti alapon az idő múlásával úgy, hogy egy logisztikus függvényt ábrázoltunk az AI-1 adatokon keresztül, meghatároztuk az egyenlet időbeli deriváltját, és a deriváltat elosztottuk az időbeli sejtsűrűséggel (1. kiegészítő táblázat), ami egy időfüggő fajlagos termelési sebességet eredményezett. Az így kapott ábrák (5d. ábra) az AI-1 termelés becsült sejtenkénti arányát mutatják a hozzáadott AI-2 és az AI-2 hozzáadásától számított idő függvényében. Amint azt később bemutatjuk, ez egybevág azzal az általunk megfigyelt alapmegfigyeléssel, hogy a génexpresszió pályája egy kezdeti jelre adott válaszként meglehetősen robusztus21,38,40.

A következőkben a PH04 fordítósejtek által termelt AI-1 hatását vizsgáltuk az AI-1-re reagáló szabályozó sejtek növekedési sebességére. Azaz a növekedésre reagáló sejteket különböző AI-2 szinteknek kitett fordítósejtekből származó AI-1-et tartalmazó CM-hez adtuk, és ~3 órán keresztül tenyésztettük (4a. kiegészítő ábra). Az 5. ábrán bemutatottakon túl, ahol az AI-1 az AI-2 közvetlen expozíciójából keletkezik, ez a kísérlet azt mutatja, hogy az AI-2 AI-1-be történő sejtfordítása a szükséges expresszióval és sejttenyésztési dinamikával úgy történhet, hogy a második populáció növekedési sebességét befolyásoljuk (4b. kiegészítő ábra). Megjegyezzük azt is, hogy a kontroller sejtek dinamikus növekedési rátája az ezt követő 3 óra alatt idővel csökkenőnek bizonyult. Ez a megfigyelés a későbbi ko-kultúrás kísérletekben még drámaibbá vált.

A ko-kultúra összetételének autonóm szabályozása

A következőkben a fordító sejteket (a továbbiakban A populáció) és az AI-1-re reagáló kontroller sejteket (B populáció) olyan oldatokhoz adtuk, amelyek különböző AI-2 kezdeti koncentrációkkal rendelkeztek. A fordítósejtek és a kontrolláló sejtek ko-kultúráiban a fordítósejtek autonóm módon szabályozzák a konzorcium összetételét a kezdeti AI-2 szint alapján. Az 5. kiegészítő ábrán látható, hogy a megnövelt AI-2 kezdeti szintű ko-kultúrák az AI-1 növekedését (5b. kiegészítő ábra) és ennek megfelelően a B populáció relatív abundanciájának növekedését eredményezték (5a. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények bizonyították a konzorciumok populációjának szignálok által közvetített autonóm szabályozásának koncepcióját. Fontos, hogy az A és B populáció növekedési sebességére vonatkozó becslések megegyeztek a monokultúrás kísérletek során mért várható növekedési sebesség értékekkel (5c. kiegészítő ábra).

Azt követően, hogy kimutattuk, hogy a fordítósejtek képesek szabályozni a konzorciumok összetételét az AI-2 expozíció alapján, matematikai modellt dolgoztunk ki a rendszer dinamikájának jellemzésére. Ily módon megjósolható a ko-kultúra viselkedése adott kezdeti feltételek, növekedési sebességtervek stb. mellett, hogy meghatározhassuk a kívánt kimenet megcélzásához szükséges paramétereket. Ezt a koncepcionálisan egyszerű matematikai modellt az egyes törzsek adatainak felhasználásával hoztuk létre a ko-kultúra viselkedésének előrejelzésére. A modell négy közönséges differenciálegyenletből áll, egyet-egyet minden egyes populációs sűrűségre, szubsztrátkoncentrációra és AI-1 koncentrációra (2. és 3. kiegészítő táblázat). A sejtnövekedés és a szubsztrátkoncentráció modellezésére Monod növekedési kinetikát használtunk állandó hozam-együtthatóval, a QS-molekulák termelését és/vagy hatásait figyelembe vevő további függvényekkel. Az A populáció által termelt AI-1 az AI-2 expozíció szintjén és az időn (fAI1) egyaránt alapul. Korábbi munkánkban38 azt találtuk, hogy a sejtek viselkedésének időfüggő pályája az autoinduktorral való kezdeti expozíció következménye, így az AI-1 termelés időfüggő függvényei itt is plauzibilisek lennének. A B populáció növekedési sebességét az AI-1 uralkodó szintje (fHPr) alapján fogalmaztuk meg. A maximális fajlagos növekedési sebességet kísérleti adatok alapján mértük, a hozamokat a kísérletileg megfigyelt stacionárius fázis sűrűsége és az ismert kezdeti szubsztrátkoncentrációk alapján becsültük, a K1 és K2 értékeket pedig a glükózra vonatkozó irodalmi értékek alapján választottuk. Az ODE-rendszer megoldására a MATLAB (R2016a verzió) ode45 megoldóját használtuk. A modell felhasználható annak bemutatására, hogy ezen egyszerű fenomenológiai sebességegyenletek és a legjobban illeszkedő állandók alapján hogyan változik előre láthatóan egy ko-kultúra populációja az idő múlásával. Mint megjegyeztük, ez biztosítja az alapot annak meghatározásához, hogy egyáltalán megjósolható-e egy ko-kultúra fejlődése a szakaszos tenyésztésben rendelkezésre álló korlátozott idő alatt. Fontos, hogy a monokultúrákból származó eredményeinket felhasználjuk a ko-kultúrákból származó kísérleti eredmények szimulálására.

Ez azt jelenti, hogy a következőkben az autonóm módon programozott ko-kultúra-szabályozást értékeltük a modelljóslatok segítségével. Az A és B populációk ko-kultúráit a kezdeti sejtpopulációk egy tartományában egymás mellé helyeztük, majd az előírt AI-2 szinteket tartalmazó médiumhoz adtuk, hogy mozgásba hozzunk egy populációs pályát. Rendszerünkben a kezdeti összetételt a ko-kultúrába juttatott sejtek aránya alapján választjuk ki, majd a kultúra összetételét idővel autonóm módon, a közegben lévő AI-2 szint alapján állítjuk be. Az eredményeket összehasonlítottuk a modellünkkel. A 6. ábrán a ko-kultúra összetétele és az AI-1 szintje látható 5 óra elteltével különböző feltételek mellett, beleértve a különböző kezdeti A:B arányokat és az AI-2 szintet. Ezekben a vizsgálatokban egy kezdeti populációs sejtsűrűséget használtunk. Fontos, hogy azt találtuk, hogy a modellünk jól megjósolta a kísérleti eredményeket mind az AI-1 szint, mind a ko-kultúra összetétele tekintetében. Megjegyezzük azt is, hogy a modell használható a kívánt eredményt adó kezdeti feltételek kiválasztására. Például, ha egy 55%-os relatív sejtsűrűségű B populációt szeretnénk elérni 5 órán belül, akkor a ko-kultúrát 60:40-es kezdeti A:B aránnyal és 40 µM AI-2 koncentrációval lehetne indítani. Az ábrán látható módon más forgatókönyveket is teszteltünk és validáltunk. Ezek az eredmények egyértelműen bizonyítják, hogy a sejtösszetétel kezdeti állapota (pl. az A:B arány) és a különböző AI-2 szinteknek való kitettség egyaránt befolyásolja a ko-kultúrás populáció pályáját. Ugyanilyen fontos azonban az is, hogy az ortogonális jelzőmolekula, az AI-1 a modellezett módon viselkedett. Arra számítunk, hogy ennek és más fordítószignáloknak a bevonásával további, változatos vagy bonyolultabb konzorciumokat lehet majd tervezni és/vagy irányítani.

Teszteltük a ko-kultúra vezérlőrendszert egy olyan AI-2 koncentrációnak, 80 µM-nak való kitettséggel, amely magasabb volt, mint a fordítósejtek jellemzésére használt AI-2 koncentrációk, és amelyre nem rendelkeztünk modellel. A ko-kultúra eredményeit (6. ábra) arra használtuk, hogy megbecsüljük a fordítósejtek viselkedését monokultúrában ezen AI-2 koncentráció mellett. Ezután monokultúrás kísérleteket végeztünk 80 µM AI-2 hozzáadásával a fordítósejtekhez, és megmutattuk, hogy a monokultúra viselkedését a ko-kultúra adatai és a modell segítségével meg tudjuk jósolni. A 6a. kiegészítő ábra a ko-kultúrás adatok és a modell alapján megjósolt AI-1-termelés mértékét (vonal) és a monokultúrás kísérlet során ténylegesen termelt AI-1 mennyiségét mutatja (adatpontok). A 6b. kiegészítő ábra a monokultúra előre jelzett AI-1 szintjét mutatja az idő múlásával, összehasonlítva a ténylegesen mért AI-1 szintekkel. Az előre jelzett AI-1 szintet a modell segítségével határoztuk meg, a becsült AI-1 termelési sebesség és a monokultúra kezdeti sejtsűrűségének megadásával.

Végül hosszabb időn keresztül teszteltük a ko-kultúrás rendszerünket, többszörös AI-2 hozzáadással történő ismételt szakaszos etetéssel (7. ábra). Itt az volt a célunk, hogy a populáció pályáját túlmutassuk azon, amit a kezdeti összetétel és a fix AI-2 szintnek való kitettség változtatásával kaptunk egy egyszerű szakaszos kultúrában. Ily módon teszteltük a szabályozási séma robusztusságát. Például a 6. ábrán a kezdetben ~40%-os B populációjú kultúrák esetében azt találtuk, hogy csak 60%-ot megközelítő B populációs szintet tudtunk elérni, és csak magas AI-2 szintnek (>80 μM) való kitettséggel. Az ismételt batch rendszer tesztelésével úgy gondoltuk, hogy a B populációt 80% fölé tudjuk vinni, ha egyszerűen újra szuszpendáljuk és időben meghosszabbítjuk a rendszert. A ko-kultúránkat különböző AI-2 szinteket tartalmazó médiumhoz adtuk, és 3 óránként reszuszpendáltuk a sejteket friss, további AI-2-t tartalmazó médiumban. Közvetlenül minden egyes reszuszpendálás előtt mintákat vettünk az AI-1 koncentráció és a sejtkultúra összetételének elemzéséhez (7a., b. ábra). A sejtsűrűséget és az AI-2 aktivitást is megmértük (7. kiegészítő ábra). Megállapítottuk, hogy ebben a bonyolultabb kísérleti elrendezésben a rendszer általában a terveknek megfelelően működött. Azt találtuk, hogy kisebb mennyiségű AI-2 expozícióval (20 és 40 μM) közel 80%-os populáció B-t tudtunk elérni. E vizsgálat során azonban azt tapasztaltuk, hogy kísérleti eredményeink eltértek a matematikai modellünk által megjósolt eredményektől. Alaposabban megvizsgáltuk a termelt AI-1 mennyiségét és a tenyészetek növekedési ütemét az egyes 3 órás szakaszok alatt, hogy a tenyészetek dinamikájának megértését az egyszerű modellel való megfigyelt eltérés alapján megismerjük. Például a második és harmadik 3 órás ciklus alatt termelt AI-1 magasabb volt, mint amit a modell előre jelzett. Utólag visszatekintve ennek azért volt értelme, mert a sejtek az első szakaszos ciklus után már termeltek LasI-t (amely az AI-1-et szintetizálja), és a további AI-2 valószínűleg a LasI további termelését indukálta (a LasI-ra nem tettünk bomlásjelzőt, így annak fenntartásával számolni kellett volna). Ezután úgy állítottuk be a modellt, hogy az AI-1 termelésének mértéke minden egyes következő, új közegben történő újraszuszpendálás kezdetén ugyanaz legyen, mint az előző ciklus végén (7c. ábra, folytonos vonalak). Az AI-1-termelés ezen új függvényeinek a modellbe való beépítése olyan AI-1 értékeket eredményezett, amelyek szorosan illeszkedtek a kísérleti AI-1 adatokhoz (7a. ábra, modell folytonos vonalakkal). Hasonlóképpen megbecsültük a szabályozó sejtek növekedési sebességét (lásd az 1. kiegészítő megjegyzést), és azt találtuk, hogy a növekedési sebesség az AI-1 koncentrációkkal kombinálva nem illeszkedik a korábbi fAI1 függvényünkhöz (7d. ábra). Megjegyezzük, hogy a vezérlősejtek növekedési sebességének kiszámításához feltételeztük, hogy a fordítósejtek növekedési sebessége állandó maradt, bár az ismételt AI-2 hozzáadás következtében kissé csökkenhetett. Míg a kontroller sejtek növekedési rátája kezdetben növekedni látszott az AI-1 függvényében, a későbbi friss táptalajban történő újraszuszpendálással az általános növekedési ráta csökkent. Korábban már megfigyeltük a növekedési sebesség dinamikus csökkenését a HPr és a LasI túlexpressziója esetén (4. és 5. kiegészítő ábra). Itt azt gyanítjuk, hogy vagy a sejtekre a magas AI-1 szintnek való ismételt kitettség miatt nehezedő anyagcsere-terhelés, vagy a csökkent szubsztrát- vagy tápanyagszint lehetett az oka a későbbi ciklusok alatti csökkent növekedésnek. Fontos, hogy a modellünket úgy módosítva, hogy az AI-1 növekedési sebességre gyakorolt hatása az idővel csökkenjen (lásd a 2. kiegészítő megjegyzést), a modell bonyolultságának növelése nélkül tudtunk illeszkedni a kísérleti adatainkhoz (7b. ábra, a módosított modell a folytonos vonalakban).

Összességében a ko-kultúrás rendszerünk a tervezett módon reagált, akár AI-2 nélküli, akár magas AI-2-tartalmú közegbe helyeztük. Sőt, eredményeink kontrollálható populációs sűrűségeket mutattak, amelyek a kontrolláló sejtek 40-80%-ára terjedtek ki. Emellett az eredeti modellünkkel való összehasonlítás betekintést nyújtott abba, hogy a rendszer hogyan viselkedett ebben a bonyolultabb kísérleti elrendezésben; úgy tűnt, hogy a fordító sejtek idővel magasabb AI-1 szintet termelnek, míg a kontroller sejteknél úgy tűnt, hogy a növekedési sebesség AI-1 által szabályozott változásai idővel csökkentek.

Végezetül a modell alapot nyújthat annak in silico vizsgálatához, hogy az itt használt, autonóm módon szabályozott kultúrákra (amelyeket a jelekkel szabályozott növekedési sebesség és a natív sejt-sejt jelátvitel jellemez) alkalmazott stratégiákat hogyan lehetne kiterjeszteni más rendszerekre, beleértve a felhasználó által szabályozott vagy programozható, dinamikusan szabályozható rendszereket. A kemosztátkultúrák például abban különböznek a jelenlegi autonóm rendszertől, hogy kimenetüket a felhasználó által meghatározott bemenetek, például a hígítási arány irányítják. Első lépésként elvégeztük a kemosztátban termesztett társkultúrák szimulációit a standard áramlási feltételek hozzáadásával a szakaszos modellhez (8. kiegészítő ábra, 4. és 5. kiegészítő táblázat). Néhány esetben azt találtuk, hogy a hígítási ráta meghatározza a kultúra állandósult összetételét, amely viszont később “hangolható” a hígítási ráta által behatárolt tartományon belül. A “hangolás” elérhető a sejt-sejt jelátvitel külső modulálásával, például jelzőmolekulák exogén hozzáadásával. Ezek az esetek azt illusztrálják, hogy az autonóm rendszerünk és más, felhasználó által vezérelt rendszerek közötti kölcsönhatás hogyan vezethet összetettebb populációs pályákhoz. Az itt bemutatott szimulációs eredményeink koncepcionális keretként szolgálnak a konzorciumok összetételének irányításához összetettebb, felhasználó által irányított rendszerekben. A kemosztát szimulációk további tárgyalása a 3. kiegészítő megjegyzésben található.