Cystine Transport and Cystinosin
Cystine accumulates within lysosomes of cystinotic leukocytes14 and fibroblasts.44 A klorokvin és a lizoszomális fehérjebontás más gátlói mérséklik a cisztin újbóli felhalmozódását a kiürült cisztinotikus sejtekben, ami arra utal, hogy a felesleges cisztin forrása az intracelluláris fehérjebontás.45 A normál és cisztinotikus sejtek cisztintartalma cisztin-dimetil-észterrel46 vagy cisztein-glutation kevert diszulfiddal44 történő terheléssel is növelhető; azonban a cisztin kilépése a lizoszómákból jelentősen károsodott a cisztinnel terhelt cisztinotikus sejtekben44,46. A nefropatikus cisztinózis gén heterozigóta hordozóitól származó sejtekből származó cisztin kiáramlása nem károsodott jelentősen a vad típusú sejtekhez képest44. A lizoszomális granulákban a cisztin-cisztin ellentranszport mérése azonban egyértelműen kimutatja annak hiányát a homozigóta betegeknél, a heterozigóta hordozók értékei pedig körülbelül a fele a normál kontrollsejtekénél47; a hibás lizoszomális cisztintranszport tehát a cisztinózis okozó hibája.
A cisztinózis gén finom feltérképezéséhez a 17p13 kromoszómán a betegek48 és a heterozigóta hordozók49 biokémiai diagnózisa egyaránt döntő jelentőségű volt. Kulcsfontosságú áttörést jelentett a genomiális deléciók kimutatása egy kapcsolt mikroszatellita marker esetében, majd a CTNS gén azonosítása a minimális deléciós intervallumon belül.50 A CTNS gén 12 exont tartalmaz, és egy 367 aminosavból álló, cisztinozin nevű fehérjét kódol. A cisztinozin hét transzmembrán doménből, egy 128 aminosavból álló N-terminusból, amely hét glikozilációs helyet tartalmaz, és egy 10 aminosavból álló citoszolikus C-terminusból áll. Úgy tűnik, hogy a cisztinózis különböző altípusaiban szenvedő valamennyi beteg a CTNS gén mutációjával rendelkezik (azaz eddig nincs bizonyíték a genetikai heterogenitásra). A leggyakoribb mutáció egy 57 kb-os deléció, amely az 10. exon 5′ régióját az exon 1051,52 felfelé mozgatja; az észak-európai származású, nefropatikus cystinosisban szenvedő betegek több mint 70%-a homozigóta erre a mutációra.52-54 Bendavid és munkatársai fluoreszcens in situ hibridizációs szondákat fejlesztettek ki erre a nagy delécióra, az első ilyen jellegű lysosomális tárolási rendellenességre.55 Külön feltételezett alapító hatású mutációkat azonosítottak Francia-Kanadában56 (W138X, ír eredetű) és Franciaország Bretagne tartományában57 (splice-site mutáció a 8. exon végén). Egy visszatérő miszense mutációt (G339R) azonosítottak két különleges etnikai populációban: két amish-mennonita származású, nem rokon családban és öt zsidó-marokkói származású, nem rokon családban.58-61 A CTNS további 50 mutációját is azonosították, köztük legalább három betegnél a gén promóter régiójában mutációval.62 A juvenilis vagy okuláris cisztinózisban szenvedő betegek homozigóták egy “enyhébb” mutációra, jellemzően egy pontmutációra, amely a nyílt olvasási keretet nem zavarja meg; alternatívaként ezek a betegek egy enyhe és egy súlyosabb mutáció összetett heterozigótái.17,59
A cisztinozin széles körben expresszálódik, különösen a hasnyálmirigyben, az izmokban és a vesében fordul elő nagy mennyiségben.50 Az anticisztinozin antitestekkel végzett immunhisztokémia63 és a sejtek epitóp-jelölt komplementer DNS-sel (cDNS)64,65 történő transzfekciója azt mutatja, hogy a fehérje a lizoszómákban expresszálódik. A várakozásoknak megfelelően a cisztinozin expressziója különösen erős a vese proximális tubulusában.63 A cisztinozin lizoszomális membránhoz való lokalizációja egyrészt a C-terminális farkán található tirozin alapú GYDQL lizoszomális rendező motívumtól, másrészt az ötödik inter-transzmembrán hurokban található YFPQA pentapeptidtől függ. Az YFPQA motívum némileg egyedülálló abban a tekintetben, hogy ritka példája a citoplazmatikus farokrészen kívül elhelyezkedő lizoszomális szortírozási jelnek.64 Úgy tűnik, hogy önmagában is képes megmenteni a cisztinozin szortírozását, mivel a GYDQL motívummal nem rendelkező, de ép YFPQA motívummal rendelkező cisztinozin mutáns még mindig részben a lizoszómákba lokalizálódik.65 A cisztinózismutációk egy kisebb része befolyásolja a cisztinozin lizoszomális célba jutását, a GYDQL-motívum elsődleges megszakadása vagy a másodlagos szerkezetre gyakorolt, még nem jellemzett hatások miatt.66
A cisztinozin funkcionális jellemzése kihasználta a fehérje átirányítását a plazmamembránba egy mutánsban, a cisztinozin-.GYDQL-ben, amelyből hiányzik a C-terminális GYDQL-motívum.67 A cisztinozin-.GYDQL tehát H+ -vezérelt cisztin transzporterként működik a transzfektált sejtek plazmamembránjában. Rendkívül specifikus az L-ciszteinre; más aminosavak, különösen a monoszulfid cisztein, nem szubsztrátok. A cisztinozin telíthető és Michaelis-Menton kinetikát követ, a cisztin Km értéke ∼280 μM.67 A befelé irányuló transzportot jelentősen serkenti a savas külső extracelluláris pH (14-6. ábra); e transzmembrán H+ gradiens összeomlása nigericin hozzáadásával megszünteti a transzportot, ami összhangban van a cisztinozin H+-cisztin kotranszportjával. A lizoszomális cisztin-transzport viszont az adenozin-trifoszfát (ATP) jelenlététől függ, amely táplálja a lizoszomális H+-ATPázt és hajtja a cisztin kiáramlását (14-7. ábra).46,68,69
A cisztinosin-.GYDQL konstrukciót a cisztinosin betegséggel összefüggő miszenzmutációinak funkcionális jellemzésére használták. A transzport és a klinikai fenotípusok többnyire korrelálnak, a transzportot a nefropatikus cisztinózishoz társuló mutációk megszüntetik, a maradék funkciót pedig a betegség juvenilis és okuláris altípusaihoz társuló mutációkat expresszáló konstrukciók közvetítik66. Ugyanakkor néhány, a juvenilis cisztinózishoz társuló mutáció megszünteti a transzportot a cisztinozin.GYDQL kontextusában, ami arra utal, hogy ezek a mutációk kevésbé hatnak a lizoszomális membránokban expresszálódó teljes hosszúságú cisztinozinra; az egyik lehetőség, hogy a cisztinozin kölcsönhatásba lép olyan lizoszomális fehérjékkel, amelyek stabilizálják ezeket a bizonyos mutáns formákat.66 A fordítottja is előfordul, így egyes nefropatikus cisztinózis mutációk minimális hatással vannak a cisztinozin.GYDQL által közvetített transzportra.66
A cisztinozin célzott deléciója egerekben cisztin felhalmozódásához vezet több szervben, beleértve a vesét is.70 A cisztinkristályok fokális lerakódása számos szövetben kimutatható, beleértve a proximális tubulus sejtjeit is. Ezek az egerek azonban nem mutatnak proximális tubulopátiát, ami arra utal, hogy a cisztinkristályok felhalmozódása önmagában nem okozója a betegségnek.70 A cisztinozinhiányos egerek szemészeti rendellenességei azonban nagyon hasonlóak a cisztinózisos betegekéhez. Ezeknél az állatoknál tehát szaruhártyájukban cisztinkristály lerakódások, retinájukban pedig depigmentált foltok alakulnak ki, ami retinopátiára utal.70