A molekuláris klónozás alapelveinek alapvető felfedezése óta, számos klónozási stratégiát fejlesztettek ki annak érdekében, hogy javítsák a DNS-darabkák újrakombinálásának egyszerűségét és sebességét. Olvasson a molekuláris klónozásban használt leggyakoribb stratégiákról, vagy szerezze be a kívánt gént a kívánt vektorba a GenEZ™ ORF klónok segítségével a legegyszerűbb módon. Kezdje a gén keresésével.
Tradicionális klónozás
A hagyományos klónozás, más néven PCR-klónozás, a polimeráz láncreakció (PCR) használatát igényli a kívánt sablonszekvencia (általában a kívánt gén) felerősítéséhez és restrikciós helyek hozzáadásához a szekvencia végein. A restrikciós enzimeket az érdeklődésre számot tartó templát és a célvektort egyaránt elvágják, a DNS-ligáz pedig a templát és a vektor ragadós végeinek összekapcsolására szolgál. A hagyományos klónozás lehetővé teszi a DNS-szekvencia rugalmas manipulálását, ami megkönnyíti szinte bármilyen kívánt konstrukció létrehozását. A hagyományos klónozáshoz szükséges ellenőrzési és optimalizálási eljárások azonban nehézkesek lehetnek, és a szükséges reagensek drágák lehetnek.
TA klónozás
A hagyományos klónozás a klónozás egyik legegyszerűbb formája. Ennél a módszernél 5′ timin túlnyúlást tartalmazó vektorokat használnak olyan PCR-termékek befogadására, amelyekben a TAQ-polimeráz amplifikáció jellege miatt további 3′ adenozin túlnyúlások kerültek hozzá. A TA-klónozás előnye az egyszerűség és a gyorsaság, mivel nincs szükség restrikciós emésztési lépésre. Ezenkívül a TA-klónozó készletek olyan reakciópuffereket tartalmaznak, amelyek az előzetesen összekevert vektort, ligázt és puffert tartalmazzák, így a ligációs reakció ideje mindössze 5 percre csökken. A TA klónozási technológia hátránya, hogy a klónozás nem irányított, ami azt jelenti, hogy a célvektorba a kívánt gént sense vagy antisense orientációban is be lehet illeszteni. Normális esetben a későbbi transzformánsok fele tartalmazza a gént sense irányban, fele pedig antisense irányban. A toxikus génekkel transzformált sejtek azonban mindegyike megjelenítheti az antisense irányú gént, mivel az értelem irányú géneket tartalmazó sejtek nem maradnak életben. Ezenkívül a túlélő sejtek, amelyek sense irányban orientált toxikus géneket tartalmaznak, mutálódhatnak, hogy kevésbé toxikus fehérjét kódoljanak.
Szegély nélküli klónozás
A szegély nélküli klónozási technológiák kiküszöbölik a restrikciós enzimek szükségességét. Ez akkor lehet előnyös, ha egy inzert számos restrikciós helyet tartalmaz a szekvenciáján belül, ami difficultussá teszi az olyan restrikciós enzimek azonosítását, amelyek a klónozási eljárás során nem vágják el a kívánt gént. A zökkenőmentes klónozás a homológ rekombinációt használja ki, és a technikának számos változata létezik. Az eljárás általában abból áll, hogy PCR segítségével körülbelül 15 bp hosszúságú flanking szekvenciákat adunk hozzá mind az inszerthez, mind a vektorhoz. Exonukleázok segítségével visszarágják az inszert és a vektor szekvenciáit, majd a DNS-t rekombináz enzimek vagy DNS-ligáz segítségével egyesítik. A zökkenőmentes klónozást egyszerűsítette az olyan készletek kifejlesztése, amelyek már tartalmazzák a célvektort és a rekombinációs reakcióhoz szükséges enzimek szabadalmaztatott keverékét. A GenScript GenBuilder™ Kit például 30 perc alatt képes akár 10 kb méretű inzerteket is klónozni, és nagy áteresztőképességű klónozási projektekhez is használható.
.