Proteins

A lizozim volt az első enzim, amelynek röntgenszerkezetét nagy felbontással határozták meg. Ezt 1965-ben David Phillips érte el, aki a londoni Royal Institutionban dolgozott. Phillips ezután javaslatot tett a lizozim hatásmechanizmusára, amely elsősorban szerkezeti adatokon alapult. A Phillips-féle mechanizmust azóta kísérleti bizonyítékok igazolták, amint azt később látni fogjuk.

A lizozim széles körben megtalálható a gerincesek sejtjeiben és váladékaiban (beleértve a könnyet és a nyálat), és a tyúktojás fehérje különösen gazdag ebben az enzimben. A lizozim katalizálja a glikozidos kötések hidrolízisét, amelyek a bakteriális sejtfalak poliszacharidjaiban az N-acetil-muraminsavat (NAM) és az N-acetilglükozamint (NAG) kötik össze. Ezáltal károsítja a sejtfal integritását, és ezáltal baktériumölő szerként működik. A NAM-NAG kötést a 40. ábra mutatja be, a lizozim általi hasítás helyét jelölve.

40. ábra A bakteriális sejtfalak poliszacharid komponensének egy része, amelyen a váltakozó N-acetil-muraminsav (NAM) és N-acetilglükozamin (NAG) maradékok láthatók. Ez a poliszacharid szubsztrát a lizozim számára, amely hidrolizálja a glikozidos kötést a jelzett pozícióban. (Az áttekinthetőség és a molekula lineáris ábrázolásának lehetővé tétele érdekében néhány kötést cikk-cakkos formában ábrázolunk.)

A lizozim egy viszonylag kis méretű enzim. A tyúktojásfehérje lizozim egyetlen, 129 aminosav hosszúságú polipeptidből áll (41. ábra), amelynek Mr 14 600. A röntgendiffrakciós adatokból látható, hogy a lizozim szerkezetében egy határozott hasadék van (42. ábra). Az aktív centrum ebben a hasadékban helyezkedik el. A 41. ábrán látható aminosavszekvenciában és a 42. ábrán látható lizozim térkitöltő modelljében azokat a maradékokat emeltük ki, amelyek az összehajtott fehérjében a szubsztrátkötő zsebet bélelik.

41. ábra A tyúktojásfehérje lizozim aminosavszekvenciája, szürkével kiemelve a szubsztrátkötő zsebet bélelő maradékokat. Az Asp 52 és Glu 35, az aktív centrum kulcsfontosságú maradékai piros, illetve sárga színnel vannak kiemelve.

42. ábra A tyúktojásfehérje lizozim térkitöltő modellje, amelyben a kulcsfontosságú maradékok ki vannak emelve. Az Asp 52 piros színnel, a Glu 35 sárgával, a szubsztrátkötő zsebet bélelő néhány maradék szürkével látható.

A lizozim aktív helye egy hosszú barázda, amely egyszerre hat poliszacharidlánc cukrot képes befogadni. A poliszacharid megkötésekor az enzim hidrolizálja az egyik glikozidos kötést. Ha a poliszacharid szakasz hat cukrát A-F-ként azonosítjuk, akkor a hasítási hely a D és E között van, amint azt a 40. ábra mutatja. A két poliszachariddarab ezután felszabadul. A 43. ábra ennek a reakciónak a szakaszait mutatja be, amelyeket az alábbiakban részletesen is ismertetünk.

43. ábra A lizozim katalitikus mechanizmusa. Megjegyezzük, hogy csak a katalízisben részt vevő kulcsfontosságú maradékok (Glu 35 és Asp 52) vannak feltüntetve. A szakaszokat a szövegben részletesen ismertetjük. (Phillips, 1966 alapján)

1. Az enzimhez való kötődéskor a szubsztrát feszített konformációt vesz fel. A D maradék eltorzul (az ábrán nem látható), hogy befogadjon egy -CH2OH csoportot, amely egyébként kedvezőtlenül érintkezne az enzimmel. Ily módon az enzim arra kényszeríti a szubsztrátot, hogy az átmeneti állapothoz közelítő konformációt vegyen fel.

2. Az enzim 35. reziduuma glutaminsav (Glu 35), amelynek protonját könnyen átadja a glikozidos kötés poláros O atomjára. Ily módon a szubsztrát C-O kötése felhasad (43a. és b. ábra).

3. A poliszacharid D maradékának most nettó pozitív töltése van; ezt a reakció közbenső terméket oxóniumionnak nevezik (43b. ábra). Az enzim kétféleképpen stabilizálja ezt a köztes terméket. Először is, egy közeli aszpartát-maradék (Asp 52), amely negatív töltésű karboxilát formában van, kölcsönhatásba lép az oxóniumion pozitív töltésével. Másodszor, a D maradék torzulása lehetővé teszi a pozitív töltés megosztását a C és O atomja között. (Megjegyzendő, hogy ezt az atomok közötti töltésmegosztást ugyanúgy rezonanciának nevezzük, mint a peptidcsoport atomjai közötti elektronmegosztást). Így az oxóniumion-intermedier az átmeneti állapot. Normális esetben egy ilyen köztes állapot nagyon instabil és reaktív lenne. Az Asp 52 segít stabilizálni az oxóniumiont, de nem lép vele reakcióba. Ennek az az oka, hogy a 3 Å távolságban a reaktív csoportok túl messze vannak egymástól.”

4. Az enzim most felszabadítja az E maradékot a hozzá kapcsolódó poliszachariddal együtt, így egy glikozil-enzim intermedier keletkezik. Az oxóniumion reakcióba lép egy vízmolekulával az oldószer környezetéből, kivonva egy hidroxilcsoportot és reprotonálva a Glu 35-öt (43c. és d. ábra).

5. Az enzim ezután felszabadítja a D maradékot a hozzá kapcsolódó poliszachariddal, és a reakció befejeződik.

A lizozim katalízis fent vázolt Phillips-mechanizmusát számos kísérleti megfigyelés alátámasztja. Különösen a Glu 35 és az Asp 52 fontosságát a folyamatban megerősítették hely-irányított mutagenezis (SDM) kísérletek. Az SDM egy nagyon hatékony technika az egyes aminosavmaradványok fehérje működésében betöltött szerepének vizsgálatára, és a 7.2. szakaszban részletesen tárgyaljuk. Az SDM rekombináns DNS-technológia felhasználásával szelektíven kicseréljük a kívánt maradékot egy másik, kritikusan eltérő tulajdonságokkal rendelkező aminosavra. Az így kapott fehérje ezután funkcionálisan tesztelhető, például a szubsztrátkötés vagy a katalitikus aktivitás tekintetében. Amikor ezt a technikát a lizozim esetében alkalmazták, hogy a Glu 35-öt egy glutamin-maradékkal (Gln) helyettesítsék, az így kapott fehérje még mindig képes volt a szubsztrátot megkötni (bár kevésbé erősen), de katalitikus aktivitása nem volt. A Glu 35 tehát elengedhetetlen a lizozim katalitikus aktivitásához. Amikor az Asp 52-t aszparagin (Asn) maradékkal helyettesítették, a mutáns fehérje a normál (vad típusú) lizozim katalitikus aktivitásának kevesebb mint 5%-ával rendelkezett, annak ellenére, hogy a mutáns forma valójában kétszer nagyobb affinitással rendelkezett a szubsztrát iránt. Ebből következik, hogy az Asp 52 esszenciális a lizozim katalitikus aktivitásához. Kísérletek olyan kémiai szerekkel, amelyek kovalens módon módosították ezeket a maradékokat, anélkül, hogy a röntgenszerkezetet jelentősen befolyásolták volna, hasonlóképpen bizonyították, hogy ezek a maradékok nélkülözhetetlenek a katalitikus aktivitáshoz.