Relationship between the Size of the Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Reservoir in Peripheral Blood CD4+ T Cells and CD4+:CD8+ T-sejtek aránya a hosszú távú, magasan aktív antiretrovirális terápiában részesülő, aviremiás HIV-1-fertőzött egyénekben

Abstract

Bebizonyosodott, hogy az 1-es típusú humán immundeficiencia vírus (HIV-1) replikációja a legtöbb, magasan aktív antiretrovirális terápiában (HAART) részesülő fertőzött egyénben fennmarad. Hiányoztak azonban azok a vizsgálatok, amelyek az alacsony szintű folyamatos vírusreplikáció és az immunológiai paraméterek, például a CD4+:CD8+ T-sejtek aránya közötti összefüggést vizsgálták az ilyen egyéneknél. Itt statisztikailag szignifikáns inverz korrelációt mutattunk ki a HIV-1 provirális DNS-t hordozó CD4+ T-sejtek gyakorisága és a CD4+:CD8+ T-sejt arány között olyan fertőzött egyéneknél, akik HAART-ot kaptak, és akiknél a plazma viremiáját hosszabb időn keresztül a kimutatási határ alá szorították. Nem találtak összefüggést a HIV-1-specifikus citotoxikus CD8+ T-limfociták (CTL-ek) gyakorisága és a CD4+ :CD8+ T-sejtek aránya között ezekben az egyénekben. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a tartós, alacsony szintű, folyamatos vírusreplikáció, bár nem elegendő a HIV-1-specifikus CTL-válasz fenntartásához, részben magyarázatot adhat arra, hogy a CD4+ :CD8+ T-sejt arány normalizálódása miért nem érhető el néhány HAART-tal sikeresen kezelt fertőzött egyénnél.

A magas aktivitású antiretrovirális terápia (HAART) alkalmazása az 1-es típusú humán immundeficiencia vírus (HIV- 1)-fertőzött egyének kezelésében drámaian megváltoztatta sok fertőzött személy klinikai kimenetelét, és az AIDS előfordulásának és a halálozásnak a jelentős csökkenéséhez vezetett . A legtöbb olyan fertőzött egyénnél azonban, akiknél a plazma viremia a kimutatási határérték alá csökkent, kimutatták a replikációképes vírus, a HIV-1 provirális DNS (beleértve a 2 hosszú terminális ismétlődő köröket is), a splicingelt és nem splicingelt HIV-1 RNS a CD4+ T-sejtekben, valamint az azonosítatlan vírustartalékok jelenlétét, és ezek a folyamatos replikáció forrásai a HIV-1 felszámolásának legfőbb akadályává váltak.

A HAART megkezdése után a fertőzött egyének nagy részénél a plazma viremia gyorsan a kimutatási határ alá csökken, amit a CD4+ T-sejtek számának fokozatos növekedése és a CD8+ T-sejtek számának csökkenése követ. A CD4+:CD8+ T-sejtek arányának normalizálódása azonban nem következik be egyes fertőzött egyéneknél, akik egyébként sikeresen reagáltak a HAART-ra . Ebben a tekintetben azt feltételezik, hogy a CD8+ T-sejtek krónikusan emelkedett szintjét vagy a perifériás vérben lévő rendellenes CD4+:CD8+ T-sejt arányt az aktív vírusreplikáció okozza a kezeletlen vagy szuboptimális antivirális terápiában részesülő fertőzött egyéneknél . Ezenkívül a CD8+ T-sejteken a CD38 aktivációs marker kifejeződése a betegség progressziójának prognosztikai markerének bizonyult . Bár felmerült, hogy a CD4+:CD8+ T-sejt arány normalizálódásának elmaradása néhány HAART-kezelésben részesülő betegnél a vírusreplikáció nem teljes szuppressziójának tulajdonítható, nincsenek olyan adatok, amelyek közvetlenül erre a kérdésre vonatkoznának, különösen olyan betegek esetében, akik már hosszabb ideje HAART-kezelésben részesülnek, és akiknél a plazma viremia jól szupprimálódott.

Megállapították, hogy a fertőzött CD4+ T-sejtek rezervoárját a perifériás vérben, amelyet a HIV-1 provirális DNS-t hordozó sejtek száma határoz meg, a folyamatos vírusreplikáció még nagyon alacsony szinten is fenntartja . Jelen vizsgálatban a CD4+:CD8+ T-sejtek számának aránya és a tisztított CD4+ T-sejtekben a HIV-1 provirális DNS-t hordozó CD4+ T-sejtek gyakorisága, valamint a HIV-specifikus citotoxikus CD8+ T-limfociták (CTL-ek) gyakorisága közötti kapcsolatot vizsgáltuk olyan fertőzött egyéneknél, akik hosszabb ideig HAART-ot kaptak, és akiknél a plazma viremiája a standard vizsgálatokkal meghatározott kimutatási szint alá szorult.

Betegek és módszerek

A CD4+ T-sejtek izolálása. A perifériás vér mononukleáris sejtjeit (PBMC) ficoll-hypaque sűrűséggradiens centrifugálással nyertük. A CD4+ T-sejteket HIV-1-fertőzött egyének PBMC-jéből izoláltuk, oszlop alapú sejtleválasztási technikával (Stem-Cell Technologies), a máshol leírtak szerint.

Kvantitatív valós idejű HIV-1 DNS PCR. A HIV-1 provírust hordozó CD4+ T-sejtek gyakoriságának meghatározására a fertőzött egyénekben valós idejű PCR-t végeztünk az alábbiakban leírtak szerint. A genomi DNS-t 1-2 × 106 tisztított CD4+ T-sejtből izoláltuk a Puregene DNS-izoláló készlet (Gentra) segítségével, a gyártó előírásainak megfelelően. A DNS-t (1 µg) ezután templátként használtuk a valós idejű PCR-hez iCyclerben (Bio-Rad). Az amplifikációs reakciót három példányban végeztük 0,5 µM primer, 0,2 µM fluoreszcens szonda, 0,8 µM dNTP, 5 µM MgCl2 és 2,5 U Platinum Taq polimeráz (Life Technologies) felhasználásával, 50 ml össztérfogatban. Az 5′- GGTCTCTCTCTGGTTAGACCAGAT-30 (5′ primer) és az 5′-CTGCTAGAGATTTTCCACACTG-3′ (3′ primer) primereket használtuk az 5′-6FAM-AGTAGTGTGTGTGTGCCCCGTCTGTTGTTTAMRA- 3′ fluoreszcens szondával együtt. A PCR körülményei a következők voltak: denaturációs lépés 95°C-on 3 percig, majd 45 ciklus 15 s 95°C-on és 1 perc 58°C-on. Sorozatosan hígított ACH-2 DNS-t is alávetettük a fenti PCR-nek, hogy standard görbéket kapjunk.

A HIV-1-specifikus CD8+ T-sejtek áramlási citometriai elemzése. A HIV-1-re specifikus CD8+ T-sejtek gyakoriságát az intracelluláris interferon (IFN)-γ-pozitív sejtek elemzésével határoztuk meg HIV-1-specifikus peptidekkel (20 mer, 15 aa átfedéssel) történő stimulációt követően. A teljes HIV-1 gag, pol, env és nef szekvenciát lefedő, átfedő peptidek pooljait (egyenként 1 µg; National Institutes of Health AIDS Reagent Program) kezdetben 3 × 106 PBMC-vel inkubáltuk 10 percig kerek aljú 5 ml-es csőben (Becton Dickinson), 0,1 ml teljes médiumban, 37 °C-os CO2 inkubátorban. Ezután 0,4 mL teljes tápfolyadékot adtunk a csőbe, majd 2 órás inkubáció után Brefeldin A-t (Sigma) adtunk a tápfolyadékhoz 10 mg/ml végső koncentrációban az IFN-γ szekréciójának gátlása érdekében. 6 órás inkubáció után a sejteket kétszer mostuk, 1× fixáló oldattal (Becton Dickinson) 10 percig szobahőmérsékleten fixáltuk, majd ismét mostuk. A sejteket 1× permeabilizáló oldattal 2 (Becton Dickinson) permeabilizáltuk, és tovább inkubáltuk szobahőmérsékleten 10 percig. Újabb mosás után a sejteket a következő antitestekkel festettük meg: fluoreszcein-izotiocianát-konjugált anti-CD8, fikoeritrin-konjugált anti-IFN-γ, peridin-klorofillfehérje-konjugált anti-CD69 és allofikocianin-konjugált anti-CD3 antitestekkel (Becton Dickinson). A CD3+CD8+ limfociták kapuján ~100 000 eseményt gyűjtöttünk össze FACSCalibur (Becton Dickinson) segítségével, és az IFN-γ + CD69+ sejtek gyakoriságát a Cellquest szoftver (Becton Dickinson) segítségével határoztuk meg.

Statisztikai elemzés. A Spearman-féle rangkorrelációt használtuk a korreláció mérésére (1) a HIV-1 provirális DNS-t hordozó CD4+ T-sejtek gyakorisága és a CD4+ és CD8+ T-sejtek száma, valamint a CD4+:CD8+ T-sejtek aránya és (2) a HIV-1-specifikus CTL-ek gyakorisága és a CD4+ és CD8+ T-sejtek száma, a CD4+:CD8+ T-sejtek aránya és a HIV-1 provirális DNS-t hordozó CD4+ T-sejtek száma között. A Fisher-féle egzakt tesztet használtuk a CD4+:CD8+ T-sejtek ⩾1,0 vagy <1,0 arányának és a CD4+ T-sejtes kompartmentben lévő provirális terhelésnek a kapcsolatára. A Bonferroni-módszert a P-értékek többszörös tesztelésre történő kiigazítására alkalmaztuk a CD4+ és CD8+ T-sejtek számának és a CD4+:CD8+ T-sejt aránynak a HIV-1 provirális DNS-t hordozó CD4+ T-sejtek gyakoriságával való összefüggéseire, valamint a CD4+ és CD8+ T-sejtek számának, a CD4+:CD8+ T-sejt aránynak és a provirális HIV-1 DNS szintjének a CD4+ T-sejt kompartmentben a HIV-1-specifikus CTL-ek gyakoriságával való összefüggéseire.

Eredmények

Korreláció a HIV-1 CD4+ T-sejtes rezervoár mérete és az immunológiai paraméterek között. A HIV-1 perifériás vér CD4+ T-sejt-rezervoárjának mérete és a kóros perifériás immunológiai paraméterek közötti összefüggés vizsgálatára olyan fertőzött egyénekben, akik hosszabb ideig sikeres HAART-kezelésben részesültek, összefüggéseket kerestünk a HIV-1 provirális DNS-t hordozó CD4+ T-sejtek gyakorisága, valamint a CD4+ és CD8+ T-sejtek száma és a CD4+ :CD8+ T-sejtek aránya között. Az általunk vizsgált fertőzött egyének perifériás vérében a HIV-1 provirális DNS-t hordozó CD4+ T-sejtek gyakorisága és a CD4+ T-sejtek száma között statisztikailag szignifikáns fordított korrelációt találtunk (P = .02; 1A ábra). Ezzel szemben a CD4+ T-sejtek HIV-1 provirális DNS-terhelése és a CD8+ T-sejtek száma között nem találtunk összefüggést (P = .34; 1B ábra). Amikor ezt a két immunológiai paramétert kombinálták és CD4+:CD8+ T-sejtek arányaként fejezték ki, erős inverz korrelációt figyeltek meg ezen értékek és a HIV-1 provirális DNS-t hordozó CD4+ T-sejtek gyakorisága között (P .01; 1C ábra). Ezenkívül a 19 beteg közül 14 (74%), akiknél a CD4+:CD8+ T-sejtek aránya ,1,0 volt, a CD4+ T-sejtekből származó genomiális DNS genomikus DNS-éből származó HIV-1 DNS provirális terhelése <1000 kópia/µg volt. Ezzel szemben 13 olyan beteg közül, akiknél a CD4+:CD8+ T-sejtek aránya >1,0 volt, 10 (77%) betegnél a CD4+ T-sejtekből származó genomi DNS provirális terhelése ,1000 kópia/mg volt (P = .01; 1C ábra).

A HIV-1-specifikus CTL-ek gyakorisága és az immunológiai és virológiai paraméterek közötti összefüggés. Kimutatták, hogy a HIV-1-specifikus CTL-ek gyakorisága fokozatosan csökken a HAART megkezdése után a HIV-1-fertőzött egyéneknél a HIV-1 antigének csökkenő elérhetősége miatt . Megvizsgáltuk a HIV-1-specifikus CTL-ek gyakorisága és a CD4+:CD8+ T-sejtek aránya közötti kapcsolatot olyan fertőzött egyéneknél, akik hosszabb ideig sikeresen reagáltak a HAART-ra. Nem találtunk statisztikailag szignifikáns összefüggést a gag, pol, env és nef génekből származó HIV-specifikus peptidekre reagáló CTL-ek gyakorisága és a CD4+:CD8+ T-sejtek aránya között (2. ábra). Ezenkívül nem találtunk statisztikailag szignifikáns korrelációt a HIV-1-specifikus CTL-ek száma és a CD4+ és CD8+ T-sejtek száma, valamint a HIV-1 provirális DNS-t hordozó CD4+ T-sejtek száma között (az adatok nem láthatóak). Megjegyzendő, hogy az alacsonyabb CD4+:CD8+ T-sejt aránnyal rendelkező egyéneknél tendencia volt a CTL-ek nagyobb száma.

Diszkusszió

A HAART széles körű alkalmazása a HIV-1 betegség kezelésében a klinikai eredmények drámai javulásához vezetett . Bár a plazma viremia sok HAART-ot kapó fertőzött egyénnél a kimutatási határ alatt tartható, a CD4+ T-sejtekben a folyamatos vírusreplikáció alacsony szintjének fennmaradása jelentős akadályt jelentett a HIV-1 felszámolásának elérésében . Valójában a vírusreplikáció tartósan alacsony szintjét tartják a HIV-1 rezervoár fenntartásában szerepet játszó fő tényezőnek, amit a HIV-1 provirális DNS-t hordozó CD4+ T-sejtek gyakorisága tükröz azoknál a betegeknél, akiknek a plazmaviremiáját a HAART a standard tesztek kimutatási szintje alá szorította. Ezenkívül a HAART-kezelésben részesülő fertőzött betegek nagy részénél megfigyelték az emelkedett CD8+ T-sejtek tartósan magas szintjét . Ebben a tekintetben azt feltételezték, hogy az aktív vírusreplikáció felelős a CD8+ T-sejtek emelkedett szintjéért, és hogy a CD38 aktivációs marker kifejeződésének szintje ezeken a sejteken a betegség progressziójának prognosztikai markerének bizonyult hatékony vírusellenes terápia hiányában .

A publikált adatok hiánya ellenére feltételezik, hogy a HAART-tal sikeresen kezelt fertőzött egyének perifériás vérében a CD4+:CD8+ T-sejtek fordított aránya a folyamatban lévő vírusreplikáció alacsony szintjének köszönhető . Jelen tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy a hosszan tartó HAART-kezelésben részesülő fertőzött egyének fordított CD4+:CD8+ T-sejt arányai a HIV-1 replikáció nem teljes szuppressziójának köszönhetőek-e, amit a CD4+ T-sejtekben lévő HIV-1 provirális DNS-rezervoár mérete tükröz. A HIV-1 provirális HIV-DNS tartós jelenlétét a CD4+ T-sejtek kompartmentjében HAART-ot kapó fertőzött betegeknél már máshol meggyőzően leírták, és úgy vélték, hogy a plazma viremia nem kimutatható szintre történő szuppressziója ellenére a fennmaradó, folyamatban lévő vírusreplikáció nem teljes gátlását tükrözi. Erős inverz korrelációt mutattunk ki a HIV-1 provirális DNS-t tartalmazó fertőzött CD4+ T-sejtek gyakorisága és a CD4+ és CD8+ T-sejtek aránya között, ami arra utal, hogy a maradék vírusreplikáció alacsony szintje részben felelős lehet a perifériás vérben a CD4+:CD8+ T-sejtek rendellenes arányáért.

A provirális HIV-1 DNS-t hordozó CD4+ T-sejtek gyakorisága ugyan közvetlenül összefügghet a CD4+:CD8+ T-sejtek arányával, más tényezők is befolyásolhatják ezt a kapcsolatot. Olyan paraméterek, mint az ismeretlen vírustartalékok létezése, amelyek a HAART jelenlétében is támogatják az aktív vírusreplikációt, a gazdaszervezet immunrendszerének rendellenességei, az adott terápiás sémák hatékonysága vagy más zavaró tényezők hatással lehetnek mind a CD4+: CD8+ T-sejtek arányára és a CD4+ T-sejtek provirálisDNS-terhelésére. Megjegyzendő, hogy adataink arra utalnak, hogy a folyamatos vírusreplikáció olyan szinteken zajlik, amelyek a plazma viremia standard vizsgálatával nem mutathatók ki, de amelyek fenntartják a HIV-1 CD4+ T-sejtek rezervoárját, bár elegendőek ahhoz, hogy megakadályozzák a CD4+ normalizálódását: CD8+ T-sejtek arányát az ebben a vizsgálatban vizsgált betegeknél, nem elegendőek a HIV-1-specifikus CTL-válaszok fenntartásához.

Azzal lehet érvelni, hogy a hosszan tartó HAART-kezelésben részesülő fertőzött egyének tartósan kóros CD4+:CD8+ T-sejt arányai immunológiai és virológiai tényezőkre is visszavezethetők. E tekintetben kimutatták, hogy a betegség progressziója és a CD4+ T-sejtek elégséges helyreállítása hiányában a teljes T-sejt-homeosztázist a fertőzött egyénekben a CD8+ T-sejtek emelkedett szintje tartja fenn, ami viszont zavarhatja a CD4+ T-sejtek regenerációját . Nem találtunk azonban összefüggést a HIV-1 provirális DNS-t hordozó CD4+ T-sejtek szintje és a CD8+ T-sejtek száma között.

Végezetül, korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a CD4+ T-sejtek keletkezését a thymusban az aktív vírusreplikáció közvetlen vagy közvetett következményei súlyosan akadályozzák . Ebben a tekintetben fertőzött egyéneknél kimutatták a tímusztermelés csökkent szintjét, amit a T-sejt receptor-újrarendeződéses kivágási köröket hordozó naiv CD4+ T-sejtek gyakoriságával mértek . Bár nem világos, hogy a CD4+ T-sejtek előfutárai fertőződnek-e a HIV-1 által a thymusban, adataink határozottan arra utalnak, hogy a vírusreplikáció nem teljes elnyomása a HAART-kezelésben részesülő fertőzött egyéneknél tovább terjed a fertőzés a perifériás vér CD4+ T-sejtes kompartmentjében, ami a HIV-1 CD4+ T-sejtes rezervoárjának fenntartását eredményezi.

Köszönet

Köszönjük Paul Parksnak a beteglátogatások ütemezését, Susan Moirnak a kézirat elolvasását és a hasznos megbeszéléseket, valamint a betegeknek a vizsgálatban való részvételüket.

Figures and Tables