Solution structure, Az Anopheles C-típusú lektinek CTL4 és CTLMA2 glikánspecificitása és fenoloxidáz gátló aktivitása

A CTL4/CTLMA2 megőrzése Anophelesben

A CTL4 és a CTLMA2 egyaránt egy jelző peptidből, egy rövid, CXCXC motívumot tartalmazó N-terminális szekvenciából és egyetlen CTL doménből áll. Egy nemrégiben készült jelentés szerint a CTL4 és a CTLMA2 vagy kofaktoraik funkciója az Anopheles-en belül eltér egymástól, és különösen az An. albimanus CTL4 nem tartalmazza a diszulfidkötésekben szerepet játszó N-terminális ciszteinmaradványokat22. Először újra megvizsgáltuk a CTL4 (AGAP005335) és a CTLMA2 (AGAP005334) ortológjait, amelyek a 2L kromoszómán szorosan egymás mögött helyezkednek el (1a. ábra), a Vectorbase24 aktuális (2019. februári állapotú) génmodelljei segítségével. N-terminális CXCXC-motívummal rendelkező fehérjéket találtunk 15/16 CTL4 ortológhoz, beleértve az An. albimanus AALB014534-et, és 13/14 CTLMA2 ortológhoz. Mind a CTL4, mind a CTLMA2 többszörös szekvencia-illesztését elvégeztük 10 ázsiai, afrikai és újvilági Anopheles fajból (1b. ábra). A gyökértelen filogenetikai fák topológiája közel azonos, és a kombinált filogenetikai fa két szimmetrikus ágat mutat, kivéve az An. dirus helyzetét az An. funestushoz és az An. maculatushoz képest.

Ez alátámasztja azt a hipotézist, hogy a CTL4 és CTLMA2 konzerválódik az Anopheles nemzetségen belül, a hiányzó ortológok pedig egyes genomok hiányos annotációját tükrözik. Három olyan faj genomikus régióját vizsgáltuk meg, amelyekről CTL4 ortológot jelentettek, de CTLMA2 ortológot nem: An. stephensi ASTE002637, An. minimus AMIN007380 és An. melas AMEC014491. Mindegyikük rendelkezik egy közeli vagy átfedő génnel inverz orientációban – ASTE002636, AMIN007379 és AMEC088499, amely két CTL-domént tartalmaz. Az An. stephensi és az An. minimus esetében a második CTL-t egy CXCXC motívum előzi meg, ami arra utal, hogy ezek CTLMA2 ortológok lehetnek. Az Aedes és Culex szúnyogok esetében a helyzet kevésbé egyértelmű. Az Ae. albopictusban egy N-terminális CXCXC-motívumot tartalmazó CTLMA2 ortológot jegyeztek fel, az AALF001196-ot, és egy közeli, hátrafelé fordított két-exonos gén, az AALF001195, amely egy szerin proteáz és egy CTL doménből áll. Az Ae. aegypti 2018. októberi génmodellje tartalmaz egy CTLMA2 ortológot N-terminális CXCXC motívummal, CTLMA14 (AAEL014382), amely jelenleg CTL4 ortológként szerepel). A C. quinquefasciatusban egy CTLMA2 ortológot jegyeztek fel, CPIJ000443, de hiányzik belőle az N-terminális CXCXC-motívum. Ez arra utal, hogy a CTLMA2 az Anopheles és az Aedes közös ősében keletkezett, míg a CTL4 Anopheles-specifikus lehet.

Biokémiai jellemzés

An. gambiae CTL4/CTLMA2 (Ag, ábra. 2a,b), CTL4 és CTLMA2 CRD-k (S1a ábra), valamint An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Aa, S1b ábra) baculovírus expressziós vektorrendszer (BEVS) segítségével rovarsejtekben expresszálódtak és homogenitásig tisztultak. Az érett AgCTL4 (25-177) moláris tömege 17,3 kDa és pI 7,7. Az érett AgCTLMA2 (18-174) moláris tömege 17,9 kDa és pI 4,5. A tisztított heterodimer molekulatömege nem redukáló (NR) SDS-PAGE-n 35 kDa (2a. ábra), méret-kiválasztó kromatográfián (SEC) pedig egyetlen csúcsként eluálódik, 40 kDa látszólagos molekulatömeggel (2b. ábra). A monomer CTL4 és CTLMA2 redukáló SDS-PAGE-n 17 kDa, illetve 20 kDa koncentrációban jelenik meg. Mint korábban megjegyeztük, a CTLMA2 megnövekedett látszólagos molekulatömege a szokatlan (savas) aminosav-eloszlását tükrözheti20.

Kimutatták, hogy az An. gambiae CTL4/CTLMA2-t az N-terminális CXCXC-motívum ciszteinjei közötti intermolekuláris diszulfid stabilizálja; e három cisztein alaninná történő mutációja megszünteti a láncok közötti diszulfidképződést20. A láncközi diszulfid helyének további pontosítása érdekében kilenc olyan mutánst állítottunk elő, amelyek egyetlen ciszteint tartalmaznak a CTL4 és CTLMA2 N-terminális CXCXC-motívumában, a fehérjéket Sf9 sejtekben koexprimáltuk, és Western Blottingot végeztünk a CTL4 és CTLMA2 kimutatására. Az intermolekuláris diszulfidképződés nem volt hatékony, de nem redukáló SDS-PAGE-n minden esetben nyilvánvaló volt (2c. ábra).

Ez arra utal, hogy az N-terminális intermolekuláris diszulfidképződés a CTL4 és a CTLMA2 között promiszkva, és nem az egyes fehérjék egy-egy specifikus ciszteinmaradványát érinti. Ha az intermolekuláris diszulfidképződés promiszkva, akkor a CTL4/CTLMA2 heterodimerek elvileg többértékű diszulfid-híddal összekapcsolt oligomereket képezhetnek. NR-SDS-PAGE-n azonban az An. gambiae CTL4/CTLMA2 esetében nem mutathatók ki diszulfid-kötésű oligomerek (2a. ábra). Hasonlóképpen, míg a CTL4 és a CTLMA2 in vitro képes diszulfid-híddal összekapcsolt homodimereket képezni20 , a tisztított termék túlnyomórészt (>95%) heterodimer. Az An. albimanus CTL4/CTLMA2 esetében néhány kisebb sáv (~10%) figyelhető meg NR-SDS-PAGE-n (S1b ábra), amelyek homodimer vagy oligomer képződést jelenthetnek.

Az An. gambiae CTL4/CTLMA2 és az An. albimanus CTL4/CTLMA2 is polidiszperz oldatban. A magasabb rendű, nem kovalens oligomerizáció a SEC-ben a fő csúcs vállaként jelenik meg a koncentráció növekedésével, és az An. albimanus CTL4/CTLMA2 esetében kifejezettebb (S1. ábra). Az oligomer fajok létezését szedimentációs sebességű analitikus ultracentrifugálással (AUC) igazoltuk (2d. ábra). pH 7,5-nél a c(s) eloszlásban csökkenő intenzitású fajok sorozata figyelhető meg: s1 = 3,1 s, s2 = 4,4 s, s3 = 5,9 s. Az oligomerizáció független a Ca2+-tól az A. gambiae CTL4/CTLMA2 esetében, de jelentősen növekszik a Ca2+ hatására az A. gambiae CTL4/CTLMA2 esetében. albimanus CTL4/CTLMA2 (S1b ábra), és a dinamikus fényszórás (DLS) szerint nem korrelál a pH-val (2e ábra).

Kalciumkötés

Mint CTL-ek, mind a CTL4, mind a CTLMA2 képes kalciumot kötni. A CTL4-ben azonban a kanonikus Ca2+ -kötő maradékok mutálódtak, ami arra utal, hogy CTLD, de nem C-típusú CRD lehet. Ezért izotermikus titrációs kalorimetriával (ITC) megmértük az An. gambiae CTL4, CTLMA2 és az An. gambiae és An. albimanus CTL4/CTLMA2 heterodimerének kalciumkötési affinitását. Egyenértékű körülmények között a CTLMA2 és a CTL4/CTLMA2 esetében kötődést figyeltek meg, de a CTL4 esetében nem (3a-c. ábra). A kötődési állandókat és termodinamikai paramétereket három független kísérlet eredményeiből számoltuk ki (1. táblázat). A CTLMA2 Ca2+ kötődésére jól illeszkedik az egyhelyű modell: KD = 173 ± 27 μM, ΔH = 12 ± 2 kcal/mol. Az An. gambiae CTL4/CTLMA2 kalcium-affinitása ~40 × nagyobb, mint a CTLMA2-é, KD = 4,9 ± 0,5 μM, ΔH = -23 ± 4 kcal/mol. Az An. albimanus CTL4/CTLMA2 (3d. ábra) hasonló affinitással rendelkezik a kalciumhoz, KD = 2,82 μM, ΔH = -12,1 kcal/mol. Azonban mind az An. gambiae, mind az An. albimanus CTL4/CTLMA2 kalciumkötése szubsztoichiometrikus volt (N = 0,36-0,50).

Glikánkötés

A CTL4 és a CTLMA2 a myeloid CTL-ek – köztük a makrofág mannózreceptor (MMR) és a DC-SIGN – vonalába tartozik, amelyek a metazoákban az immunreceptorok konzervált családját alkotják15,25. Az ismert szerkezetű CTL-ek közül a CTLMA2 30%-os szekvenciaazonosságot mutat az egér scavenger receptor (SCRL, PDB ID 2OX9)26 és a sertés surfactant protein D (SP-D, PDB ID 4DN8)27 szénhidrátfelismerő doménjével (CRD). A CTLMA2 megőrzi a glikánkötő hurokban a Ca2+ -kötéshez kapcsolódó maradékokat és a D-mannóz-szelektivitáshoz kapcsolódó kanonikus EPN-motívumot (4a. ábra). Ezzel szemben a CTL4-ből hiányzik az összes Ca2+ kötődéssel kapcsolatos maradék, ami összhangban van azzal a ténnyel, hogy ITC-vel nem figyeltek meg kötődést. Az egyetlen ismert szerkezetű CTL, amely jelentős hasonlóságot mutat a CTL4-gyel, a kínai mokaszin Deinagkistrodon acutus mérgéből származó IX/X kötőfehérje (X-bp) (1IOD). Az X-bp egy módosított CTLD, amelyben a glikánkötő domén helyébe egy hosszú hurok lép, amely a dimerizációt közvetíti a IX/X faktor kötőhely létrehozásához. Ezért, bár néhány rovar CTL-nek nincs szüksége kalciumra a glikánkötéshez, nem világos, hogy a CTL4-nek egyáltalán glikánokat kell-e kötnie.

Lektinaktivitásuk meghatározása érdekében a CTL4, CTLMA2 és a CTL4/CTLMA2 heterodimert glikán tömbökön elemeztük, amelyek 367 egyedi glikánszerkezetet28 mutatnak. Ezek a vizsgálatok számos glikánhoz való kötődést mutattak ki (2. táblázat). A CTL4 és a CTLMA2 monomerei csak négy, illetve hat glikánhoz kötődtek, míg a heterodimer 18 különböző glikánhoz. Érezhető különbség van az egyes monomerek és a heterodimer által megkötött ligandumok között; a CTL4 által felismert glikánok 3/4-ét (75%) és a CTLMA2 által felismert glikánok 2/6-át (33%) a CTL4/CTLMA2 nem ismerte fel.

A glikán array eredményeinek megerősítésére és a CTL-ek kötődési preferenciáinak meghatározására SPR-analízist végeztünk (3. táblázat). Majdnem minden kölcsönhatás esetében a glikán tömb és az SPR megegyezett a kölcsönhatások jelenlétét illetően, az SPR jelezte, hogy a glikán tömbnek négy hamis negatív eredménye volt: CTLMA2 monomer H-antigénnel, kondroitin-szulfáttal és kondroitin-6-szulfáttal, valamint CTL4 monomer kondroitin-6-szulfáttal. Az összes hamis negatív eredmény azonban a CTL4/CTLMA2 heterodimerrel való kötődést mutatott a tömbön.

A CTL-ek nem ismerték fel a mannóz-tartalmú glikánokat, kivéve a mannóz-6-foszfátot a CTL4/CTLMA2 által, a CTLMA2-ben jelen lévő kanonikus EPN-motívum ellenére. A felismert struktúrák inkább általában glikozaminoglikán (GAG) motívumok, amelyek β1-3/β1-4 kötéseket tartalmaznak a glükóz (Glc), galaktóz (Gal) és a megfelelő hexoszaminok (GlcNac és GalNac) között. A Galβ1-4Glc kötés a felismert glikánok 12/23-ban (52%) volt jelen, beleértve 6/23 (26%) Galβ1-4GlcNac-ot és 4/23 (17%) Galβ1-4GlcNac β1-3Gal vagy GlcNac β1-3Galβ1-4Glc motívumot tartalmazó keratánt.

A tömb a polimer és szulfátos glikánokat is preferálta. A CTL4 által felismert négy glikán közül a legerősebb találat a globopentaóz (Gb5, Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc) volt; a CTL4 kötötte a HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n és β1-3Glükán (Glcβ1-4Glc)n is. A CTLMA2 monomer által felismert öt glikánból három szulfátos volt, a CTL4/CTLMA2 heterodimer pedig kondroitin-szulfátot és kondroitin-6-szulfátot, hialuronsavat (GlcAβ1-4GlcNAcβ1-3)8 és HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n-t ismert fel. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a heterodimerizációnak különböző és szinergista hatásai vannak a glikánkötésre.

A CTLMA2 és a CTL4/CTLMA2 heterodimer egyaránt több fukóz tartalmú cukrot ismer fel, beleértve a szialil-LewisX és a szulfo-LewisA, de a szialil-LewisA-t nem. A legnagyobb affinitású kötődést a szulfo-LewisA-hoz figyeltük meg, a CTLMA2 (106 nM) és CTL4/CTLMA2 (95 nM) komplexhez való kötődés KD értéke ~100 nM (3. táblázat). A CTL4 esetében megfigyelt legmagasabb affinitású kötődés szintén egy szulfátos glikánhoz, a szulfo-laktozaminhoz volt (292 nM).

Szerkezeti elemzés

A CTL4 és CTLMA2 szerkezetének további vizsgálatához a CTL4 és CTLMA2 szerkezeti modelljeit (4b. ábra) a MODELLER29 segítségével, további kézi szerkesztéssel generáltuk. Mind a CTL4, mind a CTLMA2 a CTLD második hélixét követő meghosszabbított hurokkal (loop 1) rendelkezik (4a. ábra), amelyben nagy a komplementer töltésű maradékok sűrűsége; bázikus maradékok a CTL4 esetében és savas maradékok a CTLMA2 esetében. Ezen 1. hurok maradékok komplementer elektrosztatikája és az N-terminális CXCXC-motívumhoz való közelségük arra utal, hogy ez egy potenciális fehérje/fehérje interfész a heterodimerben (4b. ábra), amelyre egy hipotetikus modellt hoztunk létre egyetlen diszulfidkötéssel a CXCXC-motívumban. A glikán/Ca2+ kötőhurok azonban egy másik potenciális interfész, ahogyan azt a D. acutus X-bp két láncánál megfigyeltük. Az alternatív hipotézis szerint a két CTL-domén egymástól független, és rugalmas kötőelemek kötik össze őket a molekulák közötti hipotézisen keresztül.

A hipotézis tesztelésére a CTL4/CTLMA2 oldatszerkezetét elemeztük kisszögű röntgenszórással (SAXS). A kísérleteket 0,5 M NaCl, 20 mM CHES pH 9,0, 0,5 mM CaCl2 és 1% glicerinben végeztük a részecskék közötti kölcsönhatások minimalizálása érdekében. Ilyen körülmények között a fehérje 3,1 mg/ml koncentrációig lineáris kapcsolatot mutatott a nullszögnél extrapolált intenzitás és a koncentráció között (I0 vs. c). Az intenzitás I vs. q pufferrel kivont görbéjét (4c. ábra) SAXSMoW2 -nak vetettük alá, amely RG = 23,0 Å (I0 = 0,61) és MW = 39 kDa molekulatömeget eredményezett, ami csak 11%-kal nagyobb, mint a várt 35 kDa-os heterodimer MW30. A számított Guinier-diagram azonban csak hét adatponton alapul; a kiterjesztett tartományra való illesztés (4c. ábra, betét) RG = 24,5 Å (I0 = 0,64), míg a P(r) páros eloszlásfüggvényre való illesztés (4d. ábra) RG = 25,4 Å (I0 = 0,65) eredményt ad. A P(r) eloszlás DAMMIF31 által illesztett 20 ab initio gyöngymodellel, átlagos normalizált szerkezeti eltérés NSD = 1,0 ± 0,2 értékkel. Az ab initio modellek főtestének alakja hasonló a várt CTL4/CTLMA2 heterodimerhez.

A gyöngymodell főtestéből további sűrűség nyúlik ki, amely vagy mindkét fehérje N-terminális szekvenciáját tükrözheti, beleértve a CXCXC motívumot, vagy a CTL4/CTLMA2 kisebb populációját, amelynek nagyobb a gyűrűs sugara. E hipotézis tesztelésére a SAXS-profil többállapotú modellezését végeztük el a MULTIFOXS32 programmal. A CTL4-6xHis/CTLMA2 teljes modelljét hoztuk létre, amelynek N-terminális tekercsét egy intermolekuláris diszulfid zárja le a CTL4 C39 és a CTLMA2 C34 között. A MULTIFOXS létrehozta a modell 10 000 változatából álló együttesét a kísérleti szórásgörbével való összehasonlításhoz. Az egyetlen rugalmas maradék a CTL4 40-45 és 178-183 (6xHis), valamint a CTLMA2 35-39 volt, a két láncot összekötő merev testként egy N-terminális tekercs szolgál. A legjobb egyállapotú modell χ2 = 1,13 értékkel illeszkedett az adatokhoz, és RG = 23,7 Å volt. A legkisebb χ2 = 1,07 értéket egy háromállapotú modellel értük el (4e. ábra), amelyben a szórás 80%-át két kompakt modell adta RG = 22,0 Å és RG = 23,7 Å értékkel. Ez az adat összhangban van a CTL4 és CTLMA2 közötti kompakt heterodimer kialakulásával.

CTL4/CTLMA2 gátolja a fenol-oxidáz aktiválódását E. coli-ra adott válaszként

A CTL4 és CTLMA2 a szúnyogok fertőzésre adott melanizációs válaszának gátlójaként működik. Korábban arról számoltak be, hogy a CTL4 knockdown nem vezetett megnövekedett fenol-oxidáz (PO) aktivitáshoz E. coli és S. aureus keverékével történő fertőzésre adott válaszként20. Ugyanebben a vizsgálatban azonban azt találták, hogy a dsCTL4 és dsCTLMA2 szúnyogok kifejezetten fogékonyak voltak a Gram-negatív baktériumokra. Ezért újra megvizsgáltuk a CTL4 és CTLMA2 knockdown hatását a hemolimfa PO-aktivitására csak E. coli fertőzésre adott válaszként (5a. ábra). Az E. coli fertőzést követő 4 órában a PO-aktivitás szignifikánsan fokozódott a dsCTL4 (p = 0,02) és dsCTLMA2 (p = 0,004) szúnyogok esetében a dsLacZ kontrollokhoz képest (5b. ábra). Az átlagos knockdown hatékonyság a CTL4 és a CTLMA2 esetében 93 ± 3%, illetve 89 ± 3% volt, >80% bármelyik kísérletben.

A Plasmodium ookinéták melanizációja CTL4/CTLMA2 csendesítés hatására az LRIM117,22, TEP133 és SPCLIP133 függvénye. Mivel ezek mind a TEP1 komplement-szerű immunválasz elemei, arra következtettünk, hogy a CTL4 hiányában a fokozott PO-aktivitásnak TEP1-függőnek kell lennie. Ennek megfelelően összehasonlítottuk a PO-aktivitás fokozódását dsCTL4 szúnyogokban a dsTEP1 együttes adagolásával és a dsLacZ együttes adagolásával (5c. ábra). A TEP1 átlagos knockdown hatékonysága 82 ± 9% és >80% volt 5/6 kísérletben (64% egy kísérletben). Valójában nem volt jelentős PO-aktivitás-növekedés a dsCTL4 szúnyogokban, amikor a TEP1-et is elnémítottuk. Ez megerősíti, hogy a CTL4/CTLMA2 hiányában a melanizáció TEP1-függő.

A rekombináns CTL4/CTLMA2 E. colival történő együttes adagolása szignifikánsan megfordította a PO-aktivitás fokozódását dsCTL4 szúnyogokban a BSA-hoz képest (p = 0,007, 5d. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a CTL4/CTLMA2 közvetlenül részt vesz a PO-aktivitás negatív szabályozójaként. A dsLacZ szúnyogokban azonban a CTL4/CTLMA2 nem nyomta el az E. coli által kiváltott PO-aktivitást a szarvasmarha-szérumalbuminhoz (BSA) képest. Emellett az E. coli által kiváltott PO-aktivitás a rekombináns CTL4/CTLMA2-vel együtt injektált dsCTL4 szúnyogokban (dsCTL4 + CTL) magasabb volt, mint a BSA-val együtt injektált dsLacZ szúnyogokban (dsLacZ + BSA). Ennélfogva a rekombináns CTL4/CTLMA2 injektálása nem mentette meg teljesen az endogén fehérje elvesztését.