2016. június 1. (36. évf., 11. szám)
DeeAnn Visk Ph.D. DeeAnn Visk Consulting alapító és vezető író
A génterápiának át kell törnie a sejtes bástyákat anélkül, hogy miniatűrben újrajátszaná Jerikó bukását
A rák elleni immunterápiák, az új vírusok (vagy új helyeken lévő régi vírusok) elleni vakcinák és a patogén egysejtű hibák megoldására irányuló kísérletek mind a transzfekciós technológiát kívánják beépíteni. Ez a technológia, amely a nukleinsavak sejtekbe történő bejuttatásának különböző módjait foglalja magában, nagy ígéretet hordoz magában, de komoly kihívásokat is jelent.
Ezek a kihívások leginkább a génterápia alkalmazására irányuló kísérleteknél jelentkeztek, amelyeknek nehézséget okozott a nehezen transzfektálható sejtek, szervek és egész állatok problémájának kezelése.
Az ilyen transzfekciós kihívásokat több biotechnológiai vállalat is felvette. A MaxCyte, a Lonza és a Mirus Bio például az elektroporációt kínálja olyan módszerként, amely kevés maradványt hagy maga után. Az elektroporáció történetesen nem minden állat esetében alkalmazható, ezért más módszerekre van szükség. Az egyik alternatív technika a vírusfertőzés. Ezt olyan cégek alkalmazzák, mint a GenVec.
Egy másik, különösen a vírusos transzfekcióval kapcsolatos kihívás az immunválasz kiváltásának lehetősége. Ez a potenciális negatívum azonban valódi pozitívum lehet a megfelelő kontextusban, ami történetesen a vakcinafejlesztés. A Thermo Fisher Scientific egyik specialitása a vírustranszfekciós megközelítések kihasználása a vakcinázási mechanizmusok működtetésére. A vállalat hagyományos kémiai alapú transzfekciót is kínál, amely az egész állatban működik.
Az eddig említett vállalatok együttesen olyan technológiákat kínálnak, amelyek lefedik a terápiás szempontból releváns transzfekció minden fő módját: kémiai alapú transzfekció, nem kémiai módszerek (főként elektroporáció) és vírusos transzdukció. Hibrid megközelítéseket is fejlesztenek, amint az a következő szakaszokból kiderül.
Elektroporáció
A MaxCyte elektroporációs platformja GMP-konform és zökkenőmentesen skálázható a kutatástól a kereskedelmi léptékig. “Az áramlási elektroporációs rendszerünk lehetővé teszi, hogy kevesebb mint 30 perc alatt egymillió és több százmilliárd sejtet transzfektáljunk egy teljesen automatizált zárt rendszerben” – magyarázza Madhusudan V. Peshwa, Ph.D., CSO. “Rendszerünk ISO 9000 és FDA kompatibilis, így könnyen alkalmazkodik a terápiás szintű gyártás igényeihez.”
“Rendszeresen együttműködünk gyógyszeripari és biotechnológiai vállalatokkal ex vivo mesterséges immun- és őssejtterápiák kifejlesztésében. Néha a cél a vakcinák és a nagy hozamú biológiai gyógyszerek, például antitestek gyors előállítása. Máskor pedig lehetővé tesszük ügyfeleink számára, hogy szuszpenziós és adherens sejtek felhasználásával vírusvektorok nagyszabású, magas titertartalmú termelését valósítsák meg. Ez nemcsak a terápiás fejlesztést segíti, hanem felgyorsíthatja a gyógyszerkutatási alkalmazásokat is.”
Ez a képesség, hogy a sejteket nagy vagy kis számban lehessen feldolgozni, lehetővé teszi a kutatók számára, hogy a laboratóriumban kis sejtszámú sejtekhez áramlási elektroporációt alkalmazó folyamatprotokollt dolgozzanak ki. Ezután a folyamat méretnövelése zökkenőmentes, a minőség fenntartásának szokásos fejfájása nélkül, mivel a transzfekciós folyamat ugyanaz marad.”
“Ez a kockázatcsökkentés nagyon vonzó partnereink számára. A következetesség biztosítása a kutatástól a klinikáig, a kereskedelmi léptékig, valamint a sorozatról a sorozatra, donorról donorra és betegről betegre kritikus fontosságú a terápiák fejlesztési folyamaton való hatékony átvezetéséhez” – állítja Dr. Peshwa.
Míg a kémiai és lipides megközelítések jól működnek a kutatásban a már kialakult sejtvonalakkal, addig a primer sejtek transzfektálása gyakran nem várt következményekkel jár. Ráadásul a sejtek transzfektálásának ezeket a hagyományos kémiai módszereit nehéz ipari termelésre méretezni.
A MaxCyte által alkalmazott nem vírusos megközelítés, az elektroporáció lehetővé teszi, hogy a transzfektált sejtek biológiája bármilyen méretben természetesebb állapotban maradjon. A MaxCyte technológiája a transzfekciós folyamat során a nem szándékolt következmények megelőzésével elkerülheti az útakadályok kialakulását, miközben megoldja a magas transzfekciós hatékonyság követelményét.
“Ezeknek a terápiás beavatkozásoknak gyakorlatilag garantáltan minimális nem szándékolt negatív hatással kell lenniük a módosított sejtekre – a folyamat minden egyes szakaszában a biológiának azonosnak kell lennie” – hangsúlyozza Dr. Peshwa. “Ráadásul az áramlási elektroporációs rendszerünk automatizált módon használható. Japánban már rutinszerűen használják kereskedelmi célú terápiás kezelésekhez, és világszerte különböző fázisban van.”
Egy másik szempont az, hogy hol történik a transzfekció. A betegből kinyert sejteket egy másik városba szállítják feldolgozásra? Mi történik, ha egy csomag elveszik, vagy késik, vagy hőmérséklet-ingadozás éri? A MaxCyte által kínált platform lehetőséget kínál új terápiák kifejlesztésére a betegek sejtjeinek helyszíni feldolgozásával, megkerülve a más módszerekkel kapcsolatos jelentős logisztikai és COGS (az eladott áruk költsége) problémákat.
A sejt alapú terápiák kifejlesztése szempontjából kritikus fontosságú a sejttechnológia. A MaxCyte elektroporációs rendszere képes elkerülni a sejtfenotípus nem szándékos módosítását, miközben a vállalat szerint megfelel a sejtmérnöki kihívások legfontosabb követelményeinek: hatékonyság, konzisztencia, hordozhatóság és skálázhatóság.
Virális transzdukciók
A vírusvektorok különösen hasznosak az egész állatot érintő transzfekcióhoz vagy olyan szövetek esetében, amelyeket nehéz elérni kémiai vagy elektroporációs módszerekkel. A GenVec a vírusvektorok, különösen az adenovírus felhasználására specializálódott a gének terápiás célú szállítására.
“Első pillantásra a vírusvektorokra adott immunválaszhoz kapcsolódó problémák problematikusnak tűnnek” – magyarázza Doug Brough, Ph.D. “Azonban rájöttünk, hogy ez felhasználható az idegen anyagokra adott immunválasz serkentésére, így az adenovírusokat vakcinák beadására lehetne alkalmazni.”
A GenVec valóban alaposan tanulmányozta az adenovírust, és az adenovírusok több különböző “ízét” is létrehozta. Amikor az adenovírusokat más fajokban, például gorilla- és majomfajokban vizsgálják, a kutatók olyan vektorokat használhatnak, amelyeket úgy terveztek, hogy elkerüljék a már meglévő immunitást, amellyel az általános emberi populáció rendelkezik az adenovírusokkal szemben.
“A GenVec által kínált vektorok nagy könyvtárát Adenoverse™-nek nevezik” – tájékoztat Dr. Brough. “Az adenovírus nagy részeit töröltük, hogy korlátozzuk az adenovírusokkal való kezeléssel járó veleszületett toxicitást. Amellett, hogy megakadályozzuk a vektorra adott káros immunválaszt, ez lehetővé teszi számunkra, hogy akár 12 kb-t is beillesszünk a vírusba.”
A GenVec különböző megközelítéseket alkalmazva számos vállalattal dolgozott együtt különböző alkalmazásokon, nukleinsavterápiákon és génszerkesztési technológiákon. A módosított adenovírusok mind in vitro, mind in vivo képesek cinkujjas megközelítéseket megvalósítani.
Egy ilyen együttműködésre példa a Novartis klinikai kísérlete, amely a belső fülben lévő érzékelősejtek regenerálására irányul. “A belső fül sejtjeinek egy kulcsfontosságú szabályozó fehérjét kódoló génnel való megfertőzésével új mechanoszenzoros sejtek hozhatók létre a sérülés vagy a veleszületett genetikai feltételek miatt elvesztett sejtek pótlására” – magyarázza Dr. Brough.
Más közös projektek találhatók a rák kezelésére és vakcinák fejlesztésére irányuló entitásokban való partnerségekkel. “Amikor eljön az idő egy technológia kereskedelmi forgalomba hozatalára, a GenVec egy olyan sejtvonalat használ, amelyet az FDA korábban jóváhagyott ezekre az alkalmazásokra” – tisztázza Dr. Brough.
“Az adenovírusok használatának másik nyilvánvaló előnye, hogy könnyen transzfektálhatók egész állatok. Például a haszonállatok pusztító betegségét, a száj- és körömfájást különböző virotípusok terjesztik. A mi rendszerünk lehetővé tenné a járványt okozó törzsek gyors cseréjét, és lehetővé tenné a személyre szabott vakcina gyors beadását” – írja Dr. Brough.
Nucleofection
Lonza az elektroporáció egy fejlett formáját kínálja Nucleofection™ néven, amely sejttípus-specifikus transzfekciós oldatokat használ, egy árnyaltabb impulzus-leadó rendszerrel párosítva, amely lehetővé teszi számos különböző sejttípus, különösen normál primer emberi sejtek transzfekcióját.
“Ahelyett, hogy standard elektroporációs pufferoldatokat használnánk, sejttípus-specifikus transzfekciós oldatokat használunk” – mondja Dr. Gregory Alberts, a Lonza globális szakértője. “Ez lehetővé teszi számunkra, hogy stabilizáljuk az impulzusszállítás során keletkező pórusokat. Feltételezésünk szerint a standard elektroporáció során a sejtmembránban kialakuló pórusok gyorsan bezáródnak. A mi technológiánk stabilizálja az elektroporáció során kialakult pórusokat, és lehetővé teszi az anyag diffúzióját a sejtbe, pontosabban a sejtmagba.”
A nukleofekciós megközelítés számos különböző szubsztrátumot használ: DNS, mRNS, siRNS, peptidek, fehérjék és kismolekulák. Az siRNS-ek és mRNS-ek transzfekciós hatékonysága nagyon jó, 90%-nál jobb. A kis peptidek általában 80% körüli hatékonysággal transzfektálnak, a plazmid DNS hatékonysága pedig a sejttípustól függően 50% és 90% között van. Még a nagy szubsztrátumok, a nagyobb fehérjék, például az antitestek vagy a bakteriális mesterséges kromoszómák (BAC) is képesek a célsejtekbe jutni, ésszerűen hatékony transzfekciós hatékonysággal.
“A nukleofekció meglepően rugalmas” – állítja Dr. Alberts. “Mindenféle primer emberi sejt transzfektálására használták már. Használták iPSC (indukált pluripotens őssejtek) előállítására, CRISPR és más genomszerkesztő szubsztrátumok transzfekciójára, valamint egzotikusabb célpontok, például a maláriát okozó Plasmodium parazitacsalád transzfekciójára. Más hasonló organizmusok is transzfektálhatók a Nucleofection segítségével a trópusi betegségek kutatásának lehetővé tétele érdekében.”
A Nucleofection platform skálázható. A nagy áteresztőképességű Nucleofection rendszer például 96 lyukú és 384 lyukú formátumokat is képes kezelni. Gyakran alkalmazzák ezt a rendszert egy központi szűrőberendezésben. A kutatóhelyen dolgozó tudósok a kisebb áteresztőképességű 4D Nucleofector-t használhatják a vizsgálati feltételek optimalizálására. Mivel a bench-top 4D Nucleofector ugyanazokat a transzfekciós feltételeket használja, ugyanazokkal a sejtszámokkal dolgozik, és ugyanazt a teljesítményt nyújtja, mint a nagyobb áteresztőképességű eszközök, amikor eljön az idő a nagyobb léptékre való áttérésre, a vizsgálatot nem kell újra optimalizálni.
“A rendszer folytonossága lehetővé teszi az alma az almával való összehasonlítást, amikor a projektet felfelé vagy lefelé skálázzuk” – szemlélteti Dr. Alberts.
“Jelenleg egy új, nagy volumenű transzfekciós eszköz béta-tesztelésén dolgozunk, amely 200 millió és 1 milliárd sejt transzfektálására lesz képes 1 és 20 ml közötti formátumban. Az előzetes eredmények azt mutatják, hogy az eszköz ugyanolyan mértékben transzfektálja az elsődleges emberi sejteket vagy sejtvonalakat, mint a többi Lonza Nucleofector eszköz” – folytatja Dr. Alberts. “Ez a termék kizárólag kutatási célokra kerül forgalomba, bár mivel a Nucleofection képes ilyen jól transzfektálni az elsődleges emberi sejteket, kétségtelenül lesz érdeklődés az eszköz klinikai célú alkalmazásokban való alkalmazása iránt.”
Dr. Alberts elképzelései szerint a Nucleofection szerepet játszhat az innovatív és személyre szabott rákterápiákban, például a kiméra antigén T-sejt (CAR-T) terápiában, valamint más, primer emberi sejtek transzfekcióját vagy genomikai módosítását igénylő sejtalapú terápiákban.
“A Nucleofection azon képessége, hogy könnyen és hatékonyan transzfektálja a primer emberi T-sejteket, a betegségek kezelésére szolgáló génterápiás megközelítésekben is figyelmet fog kelteni. A Lonza megközelítése a potenciális gén-
terápiás alkalmazásokhoz nagyon kis helyigényű is. Ez kulcsfontosságú, mert a más transzfekciós technikákból származó “maradék” gépezet nem kívánt biológiai következményekhez vezethet” – zárja mondandóját Dr. Alberts.
A Lonza tudósai értékelték a vállalat Nucleofection technológiájának képességét a disszociált felnőtt patkány aorta simaizomsejtek (AoSMC) transzfekciójára. A kriokonzervált patkány AoSMC-ket felolvasztották és hét napig tenyésztették 24 lyukú tenyészlemezekben, majd a sejteket AD1 4D-Nucleofector Y oldattal adherenciában transzfektálták. Huszonnégy órával a transzfekciót követően a sejteket fixáltuk és elemeztük. Az aktin piros színnel, a GFP zöld színnel látható.
Formulációk
A Mirus Bio újszerű transzfekciós formulákat fejleszt és gyárt, amelyek lehetővé teszik számos különböző típusú nukleinsavmolekula nagy hatékonyságú és alacsony toxicitású szállítását. Számos formuláció mentes az állati eredetű összetevőktől. Az “állatmentesség” fontos tulajdonság a preklinikai és klinikai alkalmazásokban.
A CRISPR rendszerhez egy vezető RNS (gRNS) szállítására és a Cas9 endonukleáz expressziójára van szükség, amely lehet fehérje, mRNS vagy DNS formájában. A Mirus Bio transzfekciós megoldásokat kínál az összes különböző Cas9-kódoló molekula hatékony szállításának támogatására. Amikor kémiai transzfekciós módszereket használnak a Cas9 fehérje szállítására, a kutatók sokkal kisebb mennyiségű fehérjét használhatnak, ha az előkomplexálva van a gRNA-val.
“Egyes nehezen transzfektálható sejttípusok nagyobb hasítási hatékonyságot érnek el az RNP (ribonukleoprotein) komplexben lévő Cas9 fehérje transzfekciójával” – állítja Laura Juckem, Ph.D., a Mirus Bio R&D csoportvezetője. “A Mirus TransIT-X2® Dynamic Delivery System hatékonyan szállítja az RNP-komplexeket, és az elektroporációhoz képest alacsonyabb koncentrációjú Cas9 fehérje használatát teszi lehetővé.”
A vállalatok előtt álló másik kihívás az adherens kultúrákról a szuszpenziós kultúrákra való áttérés a klinikai vizsgálatokhoz szükséges nagy mennyiségű anyag befogadása érdekében. Ez különösen igaz a rekombináns lentivírusok és adeno-asszociált vírusok (AAV) előállítására. “Szorosan együttműködünk ügyfeleinkkel annak biztosítása érdekében, hogy a transzfekciók sikeresek legyenek, és hogy a munkafolyamatok megváltoztatása továbbra is kiváló minőségű terméket eredményezzen” – magyarázza Dr. Juckem.
“A sejtalapú terápiához a CHO-gro® Expression System-et úgy fejlesztettük ki, hogy szuszpenziós CHO-sejtekben magas bioterápiás fehérje-hozamot biztosítson. Ez az optimalizált rendszer elősegíti a nagy sűrűségű sejtnövekedést, és lehetővé teszi a kutatók számára, hogy elegendő fehérjét nyerjenek a preklinikai vizsgálatok és a kezdeti jellemzési elemzések elvégzéséhez” – zárja Dr. Juckem.
Az őssejtek nagy hatékonyságú transzfekcióját leíró Mirus Bio előadásból származó kép azt mutatja, hogy a szomatikus sejtek, például a felnőtt fibroblaszt sejtek transzfektálhatók vagy transzdukálhatók több módszerrel, transzkripciós faktorok kombinációjával. Miután a sejteket újraprogramozták pluripotens állapotba, növekedési faktorok hozzáadásával és/vagy sejttípus-specifikus promóterek által vezérelt szelekciós markerek transzfekciójával különböző sorsokra lehet őket irányítani. A kép kiemeli, hogy a transzfekciós reagensek több ponton is hozzáadhatók az őssejtes munkafolyamathoz.
Teljesen állati megközelítések
A Thermo Fisher Scientific lépést tart az ügyfelek azon igényével, hogy az immortalizált sejtvonalak helyett primer sejtek felhasználásával biológiailag relevánsabb adatokat hozzanak létre. Az elsődleges sejteket hagyományosan nehezebb kémiai módszerekkel transzfektálni. Az elsődleges sejtkultúrákból származó adatok azonban általában olyan válaszokat adnak, amelyek jobban átültethetők in vivo teljes állatmodellekbe.
A háromdimenziós sejtkultúrás modellek, amelyek relevánsabb eredményeket adnak, mint a kétdimenziós sejtkultúrák, hagyományos módszerekkel nehezebben transzfektálhatók.
“Az elsődleges kultúrák DNS-sel történő transzfektálása kihívást jelent. Az siRNS (kis gátló ribonukleinsav), mRNS (hírvivő RNS) és fehérje közvetlen használata könnyebben elfogadható az elsődleges sejtek számára, mivel ezeket a vegyületeket csak a citoplazmába kell juttatni, a sejtmagba nem” – állítja Xavier de Mollerat du Jeu, Ph.D., a Thermo Fisher Scientific R&D igazgatója.
“A sejtmagba juttatás a sejtosztódás során történik” – folytatja Dr. de Mollerat – “Mivel az elsődleges sejtek nem osztódnak olyan könnyen, mint a sejtvonalak, a molekulák sejtmag helyett a citoplazmába juttatásával megkerülhetjük a problémát.”
Folytatva a biológiailag relevánsabb rendszerek keresését egész állatokban, “azt találtuk, hogy az Invivofectamine® 3.0 in vivo használatával hatékonyan, 90%-kal csökkenthető egy fehérje expressziója a májsejtekben” – fejti ki Dr. de Mollerat. “Az Invivofectamine in vivo alkalmazása a tudósok számára hatékonyabb modellt ad arra, hogy a kezelések hogyan néznek ki az egész állatban.”
A transzfekciós technológia másik alkalmazási területe a vakcinák kifejlesztése. A vakcinák kifejlesztésének időigénye óriási mértékben lerövidíthető, ha transzfektált mRNS-eket használnak olyan antigének kifejezésére, amelyek ellen a szervezet immunválaszt tud kifejleszteni. Tekintettel a világban előforduló új vírusok, például a Zika és a chikungunya vírusok számára, a vakcinák gyors kifejlesztésének képessége nagyban javítja a világ egészségét.
A rákos megbetegedéseket célzó immunterápiák folyamatos fejlesztésével a T-sejteket gyakran specifikus receptorokkal célozzák meg. “Együttműködtünk az ilyen terápiák kifejlesztésében érdekelt vállalatokkal” – világít rá Dr. de Mollerat. “Szorosan együttműködünk a vállalatokkal annak a kérdésnek a megoldásában, hogy hogyan lehet ezeket a kezeléseket előállítani, nagy mennyiségben gyártani és világszerte elérhetővé tenni.”
A Thermo Fisher Scientific által az in vivo RNSi bejuttatásához biztosított Invivofectamine 3.0 reagens. A vállalat szerint egyetlen injekció már az 1. napon és akár 3 hétig is jelentős kopogtatást eredményez. Ez a megállapítás egy olyan vizsgálatból derült ki, amelyben a reagens különböző dózisokban (1, 0,5 és 0,25 mg/kg) került befecskendezésre rágcsálók farkába. A 2., 5., 9., 16., 23. és 30. napon szérumot gyűjtöttek, és a szérumot kromogén teszttel elemezték az FVII fehérje kopogtatására. A vállalat megjegyezte, hogy a beadott komplexekben lévő nagyobb mennyiségű siRNS a vizsgált tartományban hosszabb ideig tartó kopogtatást eredményezett.