1 Bevezetés
A tRNS hajtogatása és stabilitása kulcsfontosságú a hatékony transzlációhoz, és bármelyik tulajdonság hibája a tRNS mennyiségének csökkenéséhez vezethet, ami élesztőben növekedési zavarokat, emberben pedig betegségeket okozhat (Hopper, 2013; Yarham, Elson, Blakely, McFarland, & Taylor, 2010). A Saccharomyces cerevisiae élesztőben két fő sejtminőség-szabályozási útvonal ismert a hibás tRNS-fajok lebontására. Az első útvonal a nukleáris felügyeleti útvonal, amely a magban lévő pre-tRNS-re hat a nukleáris exoszóma és a TRAMP komplex segítségével (Kadaba, Wang, & Anderson, 2006; Vanacova et al., 2005) azáltal, hogy lebontja az m1A58 módosítást nélkülöző vagy félreprocesszált 3′-utánfutóval rendelkező pre-tRNSiMet (Ozanick et al., 2009) és a vad típusú (WT) pre-tRNS-ek egy részét (Gudipati et al., 2012). A második útvonal a gyors tRNS-bomlási (RTD) útvonal, amely a Rat1 és Xrn1 5′-3′ exonukleázok aktivitása révén specifikus érett, hipomodifikált vagy destabilizált tRNS-fajokat bont le (Alexandrov és mtsai., 2006; Chernyakov, Whipple, Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008). Az RTD olyan mutánsokban idéződik elő, amelyekből hiányzik a tRNS testének számos módosítása, vagy destabilizáló mutációk révén, és az összes azonosított RTD szubsztrát esetében a MET22 deléciója teljesen helyreállítja a tRNS szintjét és a növekedést (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe, Whipple, Chernyakov, Jaramillo, & Phizicky, 2012; Guy et al., 2014; Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008; Whipple, Lane, Chernyakov, D’Silva, & Phizicky, 2011). Az RTD elnyomása a met22Δ törzsekben feltehetően a Rat1 és Xrn1 exonukleázok gátlásának köszönhető a 3′-foszfo-adenozin-5′-foszfát metabolit által, amelynek szintje megnő, ha a Met22 gátolt (Dichtl, Stevens, & Tollervey, 1997; Murguia, Belles, & Serrano, 1996).A
RTD ismert, hogy több specifikus tRNS fajra hat, amelyeket hét megközelítéssel azonosítottak és tanulmányoztak (1. ábra). Az első megközelítés a tRNS-szintek genom-szerte történő összehasonlítása volt microarrays segítségével a trm8Δ trm4Δ hőmérséklet-érzékeny módosító mutánsokban (amelyekből hiányzik az m7G46 és az m5C) és a rokon törzsekben félperzitív körülmények között. Ily módon azonosítottuk az RTD szubsztrátot tRNAVal(AAC), mivel a trm8Δ trm4Δ mutánsban csökkent tRNS-szintet mutatott a WT-hez vagy a megfelelő egyedi mutánsokhoz képest (Alexandrov et al., 2006).
1. ábra. Az RTD szubsztrátok azonosítására és elemzésére használt különböző megközelítések.
A második megközelítésben északi blotok segítségével vizsgáltuk mind a tRNS lebomlásának sebességét, mind a tRNS szubsztrátok specifitását a hőmérséklet-érzékeny módosító mutánsokban. Ebben a megközelítésben a hőmérsékletváltozást követő különböző időpontokban a sejtekből izolált RNS-t elemeztük a specifikus tRNS-ek szintjeire vonatkozóan. Ebből az elemzésből azt találtuk, hogy a tRNAVal(AAC) 50%-a degradálódott a trm8Δ trm4Δ mutánsban a 28 °C-ról 37 °C-ra történő váltást követő 30 percen belül, míg a hasonlóan hipomodifikált tRNAiMet, tRNAMet és tRNAPhe nem mutatott csökkenést (Alexandrov és mtsai., 2006; Chernyakov, Whipple és mtsai., 2008). Továbbá, a töltött és nem töltött tRNS relatív szintjét mérni lehetett az északi blot savas körülmények között történő elvégzésével, ami azt mutatta, hogy a töltött tRNAVal(AAC) szintje 50%-kal csökkent a hőmérsékletváltozást követő 25 percen belül a trm8Δ trm4Δ mutánsban, és a nem töltött tRNAVal(AAC) szintje érintetlennek tűnt (Alexandrov et al., 2006).
A harmadik megközelítés a magas kópiájú tRNS szuppressziója volt, amelynek során egy adott tRNS-t expresszáló magas kópiájú plazmidot vittünk be egy hőmérsékletérzékeny tRNS-módosító mutánsba. Ha a tRNS egy RTD-szubsztrát volt, és a hőmérsékletérzékenység egyetlen tRNS-fajta lebomlásának eredménye, akkor a tRNS túlexpressziója elnyomta a hibát. Így azt találtuk, hogy a trm8Δ trm4Δ mutáns hőmérsékletérzékenységét elnyomta a tRNAVal(AAC)-t expresszáló magas kópiaszámú plazmid, ami azt jelzi, hogy a hőmérsékletérzékenység elsősorban a tRNAVal(AAC) elvesztésének köszönhető, és hogy a hiányzó módosítások fontosak a tRNS stabilitása szempontjából (Alexandrov és mtsai., 2006). Hasonlóképpen, több más tRNS-modifikációs mutáns RTD szubsztrátjait is azonosították ezzel a megközelítéssel, beleértve a tRNASer(CGA) és tRNASer(UGA) mutánsokban a tan1Δ trm44Δ (hiányzik ac4C12 és Um44) és a trm1Δ trm4Δ mutánsokban (hiányzik m2,2G26 és m5C) (Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe et al., 2012; Kotelawala et al., 2008).
Negyedszer genetikai helyettesítési megközelítést alkalmaztunk a tRNASer családban lévő RTD-determinánsok azonosítására úgy, hogy az egyetlen esszenciális tRNASer(CGA) gént (SUP61) különböző tRNASer(CGA) variánsokkal helyettesítettük a WT és a met22Δ törzsben, majd különböző hőmérsékleten vizsgáltuk a növekedést. Ezzel a megközelítéssel megállapítottuk, hogy a tRNASer(CGA) géncsaládban az akceptor és a T-törzs együttes stabilitása erősen meghatározza az RTD-érzékenységet (Whipple és mtsai., 2011). Ezt a következtetést az RTD mérésének ötödik megközelítése is alátámasztotta, amelyben in vitro kimutattuk, hogy az ac4C12 és Um44 nélküli, vagy az akceptortörzsben destabilizáló mutációkkal rendelkező tRNASer(CGA) változatok hajlamosabbak az Xrn1 általi emésztésre és érzékenyebbek a borjúbél foszfatázzal történő 5′ foszfát eltávolításra (Whipple et al, 2011).
Ebben az áttekintésben az RTD-szubsztrátok vizsgálatára nemrégiben kifejlesztett hatodik és hetedik megközelítésünket tárgyaljuk, amelyek rendkívül értékesnek bizonyultak az RTD-útvonalról alkotott ismereteink bővítésében. A hatodik megközelítés fluoreszcens riportert használ a több ezer tRNS-variánsból álló könyvtárak átfogó elemzésére WT és met22Δ törzsekben. Ezzel a megközelítéssel 643 valószínű RTD-szubsztrátjelöltet azonosítottunk, sokukat olyan régiókban, amelyekről korábbi munkák alapján nem vártuk, hogy RTD-t váltanak ki (Guy és mtsai., 2014). Bemutatjuk azokat az adatokat, amelyek bizonyítják, hogy ez a megközelítés használható a tRNS működésének vizsgálatára különböző körülmények között, és megvitatjuk a megközelítés egyéb alkalmazásait.
A hetedik megközelítés méregprimer-hosszabbítást alkalmaz a tRNS-szintek mérésére WT és met22Δ törzsben, és azért értékes, mert képes specifikusan mérni egy tRNS-variánst még a WT tRNS jelenlétében is, amelynek szekvenciája esetleg csak egyetlen maradékban tér el. Részletesen bemutatjuk ennek a megközelítésnek a módszertanát, és megvitatjuk néhány egyéb lehetséges alkalmazását.