Tumor xenograft

A xenograft bankok jellemzése

A PDX-tumorokkal való munka megköveteli egy tumorbank létrehozását és fenntartását, amelyet egerekbe ültetnek, majd generációról generációra sorban átadnak, kivéve, ha ez az eseménylánc a minták fagyasztásával megszakad. A PDX-ekről úgy gondolják, hogy a szövettani és genetikai profilok tekintetében pontosabban reprodukálják az eredeti tumor morfológiai jellemzőit, mint a létrehozott sejtvonalak xenotranszplantátumai. Ezek reprodukálják a humán rákok heterogenitását, és jobb értéket képviselnek a kezelésre adott válasz előrejelzésében.8-16

A gyulladásos elváltozások általában könnyen azonosíthatók szövettani módszerekkel. Ezzel szemben a daganatok esetében nehezebb lehet megállapítani, hogy a daganat a várt vagy más eredetű. A xenotranszplantátumok helyén ugyanis egérdaganatok alakulhatnak ki. A legtöbb ilyen daganat limfóma (4.2B. ábra)11 , de néha megfigyelhetők fusiform sejtes szarkómák (4.2C. ábra), és ritka esetekben más egértumorok, például emlőmirigy-daganatok is megfigyelhetők a nőstény egerek bőr alatti szövetében. Spontán tumorok vagy tumorszerű elváltozások távoli szervekben is kialakulhatnak, és tévesen lehetséges áttétként értelmezhetők (pl. tüdőadenomák; 4.2D ábra). A szövet egyszerű morfológiai vizsgálata általában egyértelműen jelzi, hogy a daganat az eredeti humán tumorral azonos típusú-e. Ez különösen igaz a legtöbb karcinóma xenotranszplantátumra, amelyek morfológiája nagyon különbözik a limfómákétól vagy a szarkómáétól. A karcinómákat általában nagyméretű sejtek alkotják, amelyek egyértelműen zsinórokba, tubulusokba vagy lebenyekbe rendeződnek, kiemelkedő kötőszövetes interstitiummal. A limfómák (akár humán, akár egér) kis kerek sejtek lapjaiból állnak, ritka stromával, a szarkómák pedig fusiform sejtekből álló patakokból állnak. Ezért szemmel könnyen meg lehet különböztetni ezeket a különböző daganattípusokat. A diagnózis nehezebb lehet, ha az eredeti daganat “kék daganat”, azaz nagyon kevés citoplazmával és hiperkromatikus sejtmaggal rendelkező kis sejtekből álló daganat, amely mikroszkóp alatt kis nagyításban, hematoxilinnal és eozinnal (H&E) történő festést követően mélyen bazofil (kék színű) színűnek tűnik. A blasztikus daganatok, mint például a retinoblasztóma, jellemzően kék színű daganatok. Ilyen esetekben a tumormorfológia nehezen értelmezhető, különösen azért, mert egyes tumorok legjellegzetesebb jellemzői, mint például számos blasztikus tumor rozettái, általában hiányoznak vagy rosszul reprezentáltak a xenotranszplantátumokban. Az anaplasztikus tumorok, ahol a tumorsejtek morfológiailag alig vagy egyáltalán nem hasonlítanak a normál sejtekhez, szintén nehezen jellemezhetők kiegészítő technikák nélkül. Mint említettük, míg a szarkómát viszonylag könnyű megkülönböztetni a limfómától vagy a jól differenciált karcinómától, a szarkóma xenograftok megkülönböztetése a gyulladásos elváltozásoktól vagy az egérszarkómáktól kihívást jelenthet, mivel ezek az elváltozások nagyon hasonló morfológiával rendelkezhetnek.6

Nehéz esetek esetén, vagy egyszerűen csak annak megerősítésére, hogy egy daganat valóban emberi eredetű-e a kísérlet megkezdése előtt, számos különböző, fajspecifikus fehérjék vagy nukleotidszekvenciák kimutatására tervezett, immunhisztokémián vagy in situ hibridizáción alapuló módszer használható a humán vagy egérsejtek azonosítására. A sejtvonalra jellemző fehérjék immunhisztokémiai jellemzése hasznos a tumor származási szövetének meghatározásához.

Különös figyelmet kell fordítani a humán limfómák lehetséges kialakulására a nem limfoid tumorok beültetési helyén, főként a kezdeti beültetés során.11 Az ilyen tumorok a humán sejtek specifikus markereit hordozzák; ez a valódi xenografttal való összetévesztéshez vezethet, ha az elváltozás morfológiai vizsgálatát nem végzik el. A PDX-vizsgálatokban megfigyelt humán limfómák többsége úgy tűnik, hogy a kezdeti beültetéshez használt szövetmintában jelen lévő limfocitákból fejlődik ki. Ha ezek a sejtek megfertőződnek az Epstein-Barr-vírussal (EBV), a B-limfociták átalakulhatnak tumorsejtekké.17,18 Ezeket a sejteket az immunrendszer hatékonyan eliminálja immunkompetens emberekben, míg immunhiányos egerekben történő beültetésük lehetővé teszi a rosszindulatú B-sejtek kialakulását és a kezdeti humán tumor helyének elfoglalását.11 PDX-kontextusban leírtak néhány esetben EBV-negatív perifériás humán T-sejtes limfómát is.19 Ha az eredeti humán tumor egyértelműen különbözött a limfómától (pl. adenokarcinóma), akkor a humán limfóma kialakulása könnyen kezelhető, mivel egy egyszerű morfológiai vizsgálat elegendő annak kimutatására, hogy az átültetés helyén növekvő tumor nem a várt típusba tartozik, és ezért el kell vetni. Ha az eredeti tumor “kék tumor” volt, akkor annak kimutatása, hogy az átültetés helyén talált tumor humán eredetű, további jellemzés hiányában félreértelmezéshez vezethet, mivel ez a tumor valójában egy humán limfóma lehet, amely a kezdeti tumorban jelen lévő EBV-fertőzött limfociták rosszindulatú átalakulásából származik, amint azt korábban tárgyaltuk.

Ha egy xenograftot létrehoztak (a PDX-tumorokat általában három-öt passzázs után stabilizáltnak tekintik20), azt jellemezni kell, mind szövettani típusát, mind differenciálódását tekintve. A tumor szövettani típusa általában jól megőrződik a xenotranszplantátumokban, így például az epidermoid karcinómák és a tubuláris adenokarcinómák azonos jellemzőkkel rendelkeznek, amikor PDX-et alkotnak.21 Ez a fenotípusos stabilitás feltehetően összefügg a biokémiai stabilitással, mivel a markáns biokémiai változások nem valószínű, hogy a morfológiai jellemzők megőrzését eredményeznék.6 A patológus első kérdése tehát az, hogy a jelen lévő tumor reprodukálja-e az anyaszövetek morfológiai és biokémiai jellemzőit.17 Ha nem így van, akkor lehet, hogy egy egértumornak felel meg, vagy a tumor differenciálódási mintázatában történt jelentős változás, ami további vizsgálatot igényel.8

Az első generációs transzplantációk némelyikében és egyre inkább a további passzázsok után azonban egyes tumorok hajlamosak lehetnek kevésbé differenciálódni, az adenokarcinómáknál kevesebb csatornával vagy acinussal, valamint nagyobb arányú mitózissal, nukleáris pleomorfizmussal és atípiával.20

Specifikus morfológiai részletek változhatnak a sorozatos passzázsok során, például a mucinszekréció vagy a neuroendokrin differenciálódás megszerzésével, amelyek mindkettő a tumor progressziójának kritériuma egyes karcinómákban (pl. prosztatarák).22 Hasonlóképpen, a tumor differenciálódási mintázatát megváltoztathatják a beültetési körülmények módosításai, például a gazdaszervezet hormonális állapotának változásával a kasztráció vagy hormonpótlás miatt.22

A patológusok egyik nehézsége annak meghatározása, hogy a tumor morfológiája megmarad-e az átültetés, a sorozatos passzázsok vagy a kísérletek után. Az ugyanabból a tumorból származó független xenograftok ugyanis a biológiai variabilitás és a tumoron belüli heterogenitás miatt sohasem teljesen azonosak. Még ugyanazon tumor különböző szelvényei és ugyanazon szelvény különböző régiói is mutathatnak morfológiai különbségeket. A sejtek és sejtmagjaik morfológiai jellemzői, térbeli elrendeződésük, a mitotikus index és az atipikus mitózisok jelenléte, az apoptotikus testek száma és a nekrózis gyakorisága, a sztróma mennyisége és az érrendszer eltér a különböző szelvények és területek között. A patológusnak ezért meg kell határoznia, hogy a tumor globális mintázata megmaradt-e, és ami még fontosabb, hogy a xenograftolt tumor szövettana megegyezik-e az eredeti donortumoréval. A humán tumorok nemzetközi osztályozását kell alapul venni a xenograftok pontos patológiai osztályozásához, de bizonyos fokú rugalmasságra van szükség, mivel a xenograftok soha nem reprodukálják tökéletesen az eredeti humán tumor morfológiáját.

Ha a xenograftokat egymást követő passzázsokon keresztül vagy a kísérletek során követik, a minőségi változások, mint például a trabekulárisról a tubuláris mintázatra való áttérés, ha reprodukálható, jelentősnek tekinthetők, míg a mennyiségi változásokat, mint például a mitotikus index vagy a nekrózis mennyiségének változásait, különösen ha azok finomak, nagy óvatossággal kell értelmezni.

A tumor xenobankok szövettani elemzésének másik nehézsége a morfológiai elemzés részben szubjektív jellegéből adódik. Ha a megfigyelők jól ismerik egy bizonyos típusú daganat morfológiáját, akkor az érzékelésük finoman hangolódik az apró részletek észlelésére, amelyek idővel egyre nyilvánvalóbbá válhatnak. Célszerű egy stabilizált PDX mintát kiválasztani, amelyet referenciaként használnak az új mintákkal való összehasonlításhoz, annak érdekében, hogy a tárgylemezeket a lehető legobjektívebben olvassák le. A virtuális tárgylemezek digitális bankja nagyban megkönnyítheti ezt a feladatot. Ha a vizsgált tárgylemez és a referencia között nem mutatható ki nyilvánvaló különbség, akkor az elváltozás “hasonlónak” tekinthető; ez nem jelenti azt, hogy azonosak, csak azt, hogy nem mutatható ki jelentős morfológiai változás.

A xenograft kísérletben megfigyelt első minta esetében a referenciának az eredeti humán tumor mintájának kell lennie, vagy legalább olyan morfológiai leírással kell rendelkeznie, mint a beteg patológiai jelentésében szereplő érintett tumor. Ha ilyen referencia nem áll rendelkezésre, a patológus egyszerűen azt mondhatja, hogy a tumor “morfológiailag kompatibilis” egy adott kategóriájú humán tumor xenograftjával.