D komplex képződése
A protrombináz képződése katalitikusan fontos moduláló eseményt határoz meg, mivel a teljes komplex 300 000-szer hatékonyabb, mint a prothrombinra oldatban ható szabad Xa faktor.24,72 E jelentős sebességnövekedés következménye, hogy a komplexből való bármely komponens disszociációja jelentősen és drasztikusan csökkenti az enzimaktivitást. A membránfelület hiánya a teljes katalizátorból a katalitikus hatékonyság 1000-szeres csökkenését eredményezi, míg a Va faktor eltávolítása a komplexből a trombintermelés sebességének 10 000-szeres csökkenését eredményezi.24 A membránfelületre kötelezően szükség van, mert bár a katalízis belső sebességéhez kevéssé járul hozzá, olyan környezetet biztosít, amelyben mind a Va-faktor Xa komplex, mind a szubsztrát kokoncentrálódhat.277 Úgy tűnik, hogy a protrombin nagyrészt a korábban részletezett receptor-közvetített mechanizmusok révén koncentrálódik a trombocita membránfelületén. A Va faktor membránkötő képességénél fogva obligát és nagy affinitású kölcsönhatást alakít ki a Xa faktorral, mivel a Xa faktor Va faktor hiányában nem kötődik az aktivált vérlemezkékhez. A reaktánsok koncentrációja a membránfelszínen a reagensek magas helyi koncentrációját eredményezi, amely meghaladja a reakció inherens Km értékét, és jelentősen javítja a katalitikus hatékonyságot. Ezenkívül a Va faktor egy még nem racionalizált mechanizmus révén fokozza a reakció turnover sebességét.278
A komplexképződés a prothrombináz alkotóelemek számára is védelmet nyújt az inhibitorokkal és/vagy inaktivátorokkal szemben. Az oldatban szabad Xa faktorral ellentétben a prothrombinázba beépült (azaz a membránhoz kötött Va faktorral komplexben lévő) Xa faktor védett az antitrombin III és a heparin gátlásával szemben.72 Hasonlóképpen, a prothrombinázba beépült Va faktor védett az aktivált fehérje C109,110 proteolitikus inaktiválásával szemben – ezt a folyamatot a következő fejezetben részletesen tárgyaljuk.
A belső Xa-t számos, a prothrombináznál megfigyeltekhez hasonló mechanizmus modulálja. A komplexképződés körülbelül 2 × 107-szeres katalitikus hatékonyságnövekedést eredményez.217 A VIIIa és IXaβ faktorok trombinaktivált vérlemezkékhez való kötődése 2500-szorosára csökkenti az X faktor aktiválásának Km értékét, és lehetővé teszi a VIIIa faktor számára a kcat körülbelül 7500-szoros növelését. Az antitrombin III nem képes gátolni a IXaβ faktort VIIIa faktor és vérlemezkék jelenlétében.279 Hasonlóan a Va faktorhoz, a VIIIa faktor IXaβ faktorral való komplexképzése modulálja a faktor aktivitását. Az A2 alegység disszociációját a VIIIa faktor heterotrimeréből, ami a kofaktor aktivitás teljes elvesztését eredményezi, megakadályozza az IXaβ faktorral való társulása a membránfelületen,280 ahogyan az APC általi inaktiválása is.62,281
Mivel a fiziológiailag releváns trombinképződéshez feltétlenül szükséges a Va faktor, a protrombin aktivációjának jelentős eltérései az aktivált C fehérje által katalizált kofaktor proteolitikus, inaktiváló változásain keresztül valósulhatnak meg.282 A proteolízis és az inaktiválás megköveteli, hogy a Va faktor trombocita59,74 vagy membránhoz kötött legyen.282 Korai vizsgálatok azt mutatták, hogy az aktivált fehérje C trombin aktivált vérlemezkékkel való inkubálása a Xa faktor kötődésének és a protrombin aktiválásának párhuzamos csökkenését eredményezte, ami arra utal, hogy az aktivált fehérje C általi hasítás után a Va faktor nem köti a Xa faktort.283,284 Ezért a Va faktor aktivált fehérje C-katalizált inaktiválása drámai hatással van a trombintermelésre.
A humán trombociták képesek elősegíteni és modulálni a plazma- és trombocitaeredetű Va faktor aktivált fehérje C-katalizált inaktiválását, bár ez a két kofaktortartalék nem egyenértékű szubsztrát az inaktiválás szempontjából. A humán Va faktor molekula nehézláncának három hasadása szükséges a hatékony aktivált fehérje C-katalizált inaktiváláshoz: Az Arg506-os hasadás, amelyet az Arg306-os és Arg679,282,285 Arg506-os hasadás gyorsabb, és megelőzi a membránfüggő, inaktiváló hasadást Arg306-nál,282 A trombinaktivált, humán trombocita felszíne fontos szerepet játszik a vérlemezke-eredetű Va faktor és a Va faktor Va-változat, a VaLeiden faktor aktivált fehérje C-katalizált inaktiválásában.109,110 A VaLeiden faktor a VLeiden faktor trombinaktiválásával keletkezik, egy olyan variáns, amelyben az Arg506-ot glutaminra cserélték, lényegében eltávolítva az aktivált fehérje C hasítási helyet az 506-os pozícióban.286 Így az erre a mutációra homozigóta (és néhány esetben heterozigóta) egyének gyenge antikoaguláns választ mutatnak az aktivált fehérje C-re, és fokozott a vénás trombózis kockázata.287-289 A normál és a mutáns trombocita kofaktorokat az aktivált protein C közel azonos sebességgel inaktiválja; azonban mindkét trombocita-eredetű kofaktor teljes inaktiválása soha nem érhető el,109,110 mert az eredeti aktivitásnak akár 50%-a is megmarad. Ezek az eredmények szöges ellentétben állnak azzal, amit a plazmából származó Va faktor és VaLeiden faktor szintetikus foszfolipid vezikulákon történő, aktivált fehérje C-katalizált inaktiválásával kapcsolatos vizsgálatok során megfigyeltek.290-292 Ezekben a vizsgálatokban mindig megfigyelhető a kofaktorok teljes inaktiválása, bár a plazma VaLeiden faktor lényegesen lassabban inaktiválódik, mint a normál plazma Va faktor. Vérlemezkékkel végzett vizsgálatokban mind a vérlemezkéből származó Va faktor, mind a VaLeiden faktor nagyobb maradék aktivitása megmarad, ha trombin aktivált vérlemezkéket használnak inaktiváló membránfelületként, szemben a közel teljes inaktivációval, ha szintetikus foszfolipid vezikulákat használnak inaktiváló felületként.110 Tehát az aktivált vérlemezkék megvédik a vérlemezkéből származó kofaktorokat az aktivált fehérje C-katalizált inaktivációtól.109,110
Az aktivált trombociták a normál plazmaeredetű Va faktort is megvédik az aktivált fehérje C általi inaktiválástól az Arg506-nál történő hasítás lassításával.110 A trombocitaeredetű kofaktorral ellentétben azonban a plazmaeredetű Va faktor teljesen inaktiválható az aktivált fehérje C által, ami arra utal, hogy a két különböző kofaktor-pool (plazma vs. trombocita) különböző szubsztrátokat jelent az APC számára.110 Ezek a vizsgálatok ismét megerősítik a kötési események fontosságát a prothrombináz aktivitás modulálásában. Azt is bizonyítják, hogy a trombocita- és a szintetikus foszfolipidmembránok nem egyenértékű felületek az enzimkomplex-képződés szabályozásában. Ezek a vizsgálatok együttesen azt jelzik, hogy a vérlemezkék fenntartják a prokoaguláns eseményeket azáltal, hogy olyan membránfelületet biztosítanak, amely késlelteti a kofaktorok inaktiválódását, és olyan kofaktormolekulát szabadítanak fel, amely aktivált protein C-rezisztens fenotípust mutat.
Egy érdekes megfontolás, hogy az artériás sérülés helyein a VLeiden faktor mutációja talán nem jelzi olyan könnyen előre az artériás trombózist, mivel a normál és a variáns vérlemezke-eredetű kofaktorok egyformán rezisztensek az aktivált protein C-vel szemben az aktivált vérlemezke felületén. Valójában a VLeiden faktor mutáció kimutatott szerepe a vénás trombózis előrejelzésében287-289 tükrözheti a plazmából származó VaLeiden faktor kofaktor dokumentált rezisztenciáját a normál, plazmából származó Va faktorhoz képest.290-292 A plazma kofaktor-állománya jelentősebb szerepet játszhat a vénás trombózisban, mivel hiányzik a jelentős trombocita hozzájárulás. Ezzel szemben az artériás trombus helyén a vérlemezke-eredetű kofaktor a felszabadulás és aktiváció következtében a plazma kofaktor 600-szorosát meghaladó koncentrációban lehet jelen.106
.