Elisabeth se casó con Felipe II de España, hijo de Carlos V, emperador del Sacro Imperio Romano Germánico, y de Isabel de Portugal en 1559. En un principio se casó por poderes en Notre Dame (con el duque de Alba en lugar de Felipe) antes de salir de Francia, pero la ceremonia real tuvo lugar en Guadalajara, España, a su llegada. El matrimonio fue el resultado de la Paz de Cateau Cambrésis (1559). Su segunda esposa, María I de Inglaterra, había muerto recientemente, lo que convirtió a Isabel de Valois en la tercera esposa de Felipe.
En su boda conoció al pintor Sofonisba Anguissola, y a Ana de Mendoza, que viviría con ella el resto de su vida. Felipe II nombró a Anguissola dama de compañía y pintora de la corte de su reina. Bajo la tutela de Anguissola, Isabel mejoró sus habilidades pictóricas como aficionada. Anguissola también influyó en las obras artísticas de sus hijas, Isabella Clara Eugenia y Caterina Michaela, durante su estancia en la corte.
Felipe estaba completamente encantado con su novia de 14 años, y en 1564 había abandonado sus infidelidades. A pesar de la importante diferencia de edad, Isabel también estaba bastante satisfecha con su marido. (En cartas a su madre, se proclamaba afortunada por haberse casado con un príncipe tan encantador). A Felipe le gustaba organizar torneos de caballería para entretener a su esposa. Isabel hacía de dama de honor de los tres jóvenes príncipes de la corte española: Carlos, Príncipe de Asturias, Juan de Austria (hijo ilegítimo de Carlos V), y Alejandro Farnesio, Duque de Parma (hijo de la hija ilegítima de Carlos V, Margarita).
Inicialmente, Isabel había sido prometida al hijo de Felipe, Carlos, Príncipe de Asturias, pero las complicaciones políticas obligaron inesperadamente a casarse con Felipe. Su relación con su problemático hijastro Carlos era cálida y amistosa. A pesar de los informes sobre su comportamiento progresivamente extraño, Carlos siempre fue amable y gentil con Isabel. Cuando fue necesario que Felipe lo encerrara (lo que condujo a la muerte del príncipe), Isabel lloró durante días.
Felipe estaba muy unido a Isabel, permaneciendo a su lado incluso cuando estaba enferma de viruela. El primer embarazo de Isabel, en 1560, se saldó con un hijo nacido muerto, seguido en 1564 de un aborto espontáneo de dos niñas. Más tarde dio a luz a la infanta Isabel Clara Eugenia de España el 12 de agosto de 1566, y luego a la hermana menor de Isabel, Catalina Michelle de España, el 10 de octubre de 1567. Felipe e Isabel se mostraron muy cercanos a sus dos hijas comprándoles mermeladas, muñecas, juguetes y demás. Se dice que «ambos se alegraron del nacimiento de Isabel como si hubiera sido el nacimiento de un hijo». El 3 de octubre de 1568, Isabel sufrió otro aborto y murió el mismo día, junto con su hija recién nacida.
Tras la muerte de Isabel, Catalina de Médicis ofreció a su hija menor, Margarita, como novia para Felipe. Felipe rechazó la oferta.