Co-coltura batterica con traduttore di segnalazione cellulare e moduli di controllo della crescita per una composizione della coltura regolata autonomamente

Tasso di crescita cellulare controllato dal segnale AI-1

Abbiamo prima testato il controllo del tasso di crescita cellulare di E. coli attraverso la regolazione trascrizionale di ptsH, un gene coinvolto nel trasporto dello zucchero. HPr (codificato da ptsH) è ampiamente riconosciuto come uno di una serie di proteine (ad esempio, E1, HPr, EII) che trasferisce sequenzialmente un gruppo fosforilico dal fosfoenolpiruvato (PEP) al glucosio (o altro carboidrato PTS)34. HPr è altamente conservato37. Abbiamo recentemente scoperto che HPr interagisce con la chinasi AI-2 LsrK, influenzando l’assorbimento di AI-235. Abbiamo sfruttato la funzionalità modulante AI-2 più tardi quando si costruisce la cella di rilevamento AI-2. Qui, abbiamo dimostrato che i ceppi mutanti ptsH crescono più lentamente rispetto ai ceppi wild type in mezzi minimi contenenti glucosio (Fig. 1a supplementare). Quando ptsH è stato posto sotto un promotore inducibile IPTG in un mutante ptsH, il tasso di crescita potrebbe essere controllato in base all’aggiunta di IPTG (Fig. 1b supplementare). È importante che abbiamo dimostrato che l’induzione dell’espressione di ptsH si traduce in un aumento del tasso di crescita cellulare. Altrettanto importante, questo comportamento è indipendente dal fatto che i media contengano o meno il glucosio come fonte principale di carbonio (Fig. 1c supplementare).

Sulla base di questa prova di concetto, abbiamo poi ingegnerizzato il segnale QS controllato il tasso di crescita. Per costruire il ceppo di controllo, ptsH è stato posto sotto il controllo del promotore QS AI-1 lasI sul plasmide pAHL-HPr (Fig. 2a) in un ceppo mutante ptsH PH04. Altrove sul plasmide sia dsRedExpress2, per la visualizzazione delle cellule, che LasR, richiesto per l’attivazione del promotore lasI, sono stati espressi sotto un promotore costitutivo T5. L’aggiunta di AI-1 al ceppo di controllo ha aumentato il tasso di crescita cellulare fino a 1,8 volte il tasso di crescita di base in modo dipendente dalla dose (Fig. 2b). Il tasso di crescita specifico misurato (tra 1 e 4 ore dopo l’aggiunta di AI-1) è servito come base per un modello di tipo Monod del tasso di crescita basato sul livello di AI-1 (Fig. 2c).

AI-1 modula la composizione in co-culture di cellule controller

Le cellule controller regolate da AI-1 sono state poi co-culturate con altri ceppi per verificare che l’aggiunta di AI-1 alterasse la composizione della co-cultura. Le cellule di controllo della crescita che esprimono una proteina fluorescente rossa (PH04 pAHL-ptsH) sono state co-coltivate con PH04 pCT6 o TOP10 pT5G7. PH04 pCT6 ha un tasso di crescita di base simile a PH04 pAHL-ptsH, mentre TOP10 pT5G cresce significativamente più velocemente. Le colture sono state inoculate a densità cellulari approssimativamente uguali e integrate con vari livelli di AI-1. Dopo 8 ore, i campioni sono stati presi per l’analisi utilizzando la microscopia a fluorescenza e quantificati utilizzando ImageJ. Come previsto, quando le cellule di controllo sono state coltivate con PH04, la composizione della cultura delle cellule di controllo è aumentata con l’aumentare della concentrazione di AI-1 (Fig. 3a). Una tendenza simile è stata vista quando le cellule sono state coltivate con TOP10, nonostante il tasso di crescita più veloce di TOP10 (Fig. 3b). Cioè, nelle co-colture senza AI-1, la frazione delle cellule di controllo nelle co-colture TOP10 in realtà è scesa significativamente dall’iniziale ~0,5 a ~0,09 durante le successive 8 ore. L’aggiunta di AI-1 ha contrastato la differenza del tasso di crescita e ha portato a un livello più alto di cellule di controllo durante lo stesso periodo di 8 ore. Questi risultati dimostrano che, indipendentemente da altri ceppi nella cultura e dai loro rispettivi tassi di crescita, AI-1 (che non è una molecola di segnalazione QS di E. coli) modula il tasso di crescita del ceppo di controllo ingegnerizzato e il cambiamento si è verificato in modo sufficientemente rapido da consentire un cambiamento osservabile nella composizione della cultura, in particolare anche in condizioni di batch relativamente a breve termine (al contrario delle colture a batch alimentato, a batch ripetuto o continuo).

In seguito, il ceppo regolatore AI-1 è stato co-culturato con cellule che producono AI-1 quando indotto. PH04 pSox-LasI e PH04 pAHL-HPr sono stati co-coltivati insieme. Il plasmide pSox-LasI contiene lasI, che sintetizza AI-1, sotto il promotore soxS inducibile con piocianina7. In questo esperimento, il ceppo controllore riceve un segnale da un ceppo traduttore che, a sua volta, ha prodotto AI-1 in risposta alla piocianina. In questo modo, lo schema di controllo della co-cultura è dimostrato di rispondere a un particolare spunto molecolare. Qui, ogni cultura è stata inoculata a densità di partenza approssimativamente uguali e le co-culture sono state esposte o meno alla piocianina. Le culture esposte hanno mostrato un aumento della produzione di AI-1 e un corrispondente aumento della composizione di PH04 pAHL-HPr entro 5 ore (Fig. 3c). Questi risultati dimostrano che l’AI-1 prodotto da un ceppo alternativo può modulare il tasso di crescita del ceppo di controllo, e che questo può avvenire in tempi necessari per influenzare il cambiamento in un processo batch. Inoltre, questo dimostra la potenziale fattibilità di una co-cultura regolata dall’utente basata su un’applicazione specifica di una molecola o induttore, in questo caso la piocianina. Abbiamo poi ingegnerizzato il ceppo traduttore per creare una co-cultura regolata autonomamente basata sulla pervasiva molecola di segnalazione AI-2.

Progettazione di cellule traduttrici sensibili ad AI-2

Per costruire linee cellulari che percepiscono AI-2 e producono AI-1, abbiamo ingegnerizzato ceppi per attivare l’espressione di LasI, che sintetizza AI-1, quando il promotore AI-2 lsr è attivato. Abbiamo usato un sistema a due plasmidi per amplificare l’espressione del debole promotore lsr25 (Fig. 4a). In breve, AI-2 è fosforilato da LsrK e AI-2 fosforilato allevia la repressione del promotore da LsrR, aumentando la trascrizione dei geni trasportatori lsr e accelerando l’assorbimento di AI-2. Allo stesso tempo, l’attivazione mediata da AI-2 del promotore di lsr porta alla trascrizione di T7 RNA polimerasi dal plasmide pCT6 e alla successiva trascrizione di lasI dal plasmide pET-LasI.

Il sistema è stato costruito nel ceppo ospite E. coli CT104, che è un mutante luxS (ad esempio, incapace di produrre AI-2). CT104 manca anche di lsrFG, responsabile della degradazione del segnale fosforilato AI-2, aumentando la sensibilità della cellula a AI-238. Abbiamo verificato questa linea cellulare, CT104 pCT6 pET-LasI, prodotto AI-1 quando coltivato in mezzi condizionati (CM) da AI-2 producendo BL21 (Fig. 2 supplementare). BL21 sono stati coltivati a varie densità delle cellule, CM è stato raccolto, e CT104 cellule sono state coltivate in CM raccolti. È importante notare che l’AI-1 prodotta dalle cellule CT104 era correlata alla densità delle cellule BL21 produttrici di AI-2 (Fig. 2a supplementare). Abbiamo anche testato se le cellule traduttrici aggiunte a consorzi con frazioni variabili di cellule produttrici di AI-2 potrebbero produrre il segnale AI-1 in base alla composizione del consorzio. Le cellule CT104 sono state aggiunte a colture di vari rapporti di BL21 (luxS +) a BL21 ΔluxS. Dopo 6 ore, il livello del segnale AI-1 nei mezzi extracellulari era indicativo della composizione della cultura, che, a sua volta, si basa principalmente sulla frazione iniziale di cellule luxS +25 (Fig. 2b supplementare).

Gli esperimenti di cui sopra hanno dimostrato che una linea cellulare potrebbe essere costruita per produrre AI-1 in risposta a AI-2 da cellule che producono AI-2. Questi esperimenti sono stati eseguiti in mezzi LB e non in mezzi con glucosio. La presenza di glucosio inibisce l’assorbimento di AI-2 e l’attività del promotore lsr39 e l’uso delle cellule CT104 potrebbe potenzialmente essere limitato a mezzi senza glucosio (vedi Fig. 3 supplementare per lo schema del percorso AI-2 QS). Sulla base della conoscenza del sistema AI-2 QS, abbiamo cercato di ingegnerizzare un ceppo che era in grado di AI-2 uptake e l’attivazione del promotore lsr in media contenenti glucosio. In questo modo, i nostri risultati potrebbero essere applicati più generalmente. In precedenza, abbiamo dimostrato che HPr (codificato da ptsH) interagisce con LsrK, inibendo l’attività della chinasi LsrK, e che i mutanti ptsH hanno dimostrato di assorbire AI-2 anche in mezzi contenenti glucosio35. Quindi, abbiamo ipotizzato, l’uso di PH04 (ΔptsH ΔluxS) come un ceppo ospite permetterebbe per AI-2 basato sulla produzione di AI-1 in mezzi contenenti glucosio. Abbiamo testato le cellule traduttrici utilizzando entrambi i ceppi ospiti in LB e M9 media di glucosio con e senza AI-2. Il livello di AI-1 prodotto dipendeva dall’aggiunta di AI-2, ma anche dal ceppo ospite e dai media (Fig. 4b). Entrambi i ceppi hanno prodotto AI-1 quando le cellule sono state aggiunte ai mezzi LB con AI-2. Come previsto, in M9 media, utilizzando il ceppo ospite CT104 ha portato ad un piccolo o insignificante cambiamento di fold in attività AI-1 quando si confrontano le culture con e senza AI-2. Tuttavia, le cellule traduttrici PH04 hanno mostrato una produzione attivata da AI-2 di AI-1 in mezzi M9 + glucosio. In questo modo, il sistema ingegnerizzato potrebbe essere usato in mezzi contenenti glucosio.

Caratterizzazione delle cellule traduttrici PH04

Le cellule traduttrici PH04 assorbono la molecola del segnale AI-2, trasducono il segnale attivando l’espressione di LasI e sintetizzano e secernono AI-1. L’uscita AI-1 desiderata è quindi una funzione dell’ingresso AI-2. Abbiamo caratterizzato la produzione di AI-1 segnalata da AI-2 nel ceppo traduttore PH04 nel tempo e per una gamma di concentrazioni biologicamente rilevanti di AI-2. Il tasso di produzione di AI-1 da parte delle cellule traduttrici PH04 è risultato essere dipendente dalla dose di AI-2 (Fig. 5a). Notiamo che in queste e simili condizioni, AI-2 è per lo più consumato entro 4 ore (Fig. 5b). L’aggiunta di AI-2 o la produzione di AI-1 basata su AI-2 in queste colture in batch non ha portato ad una diminuzione osservabile della crescita cellulare (Fig. 5c). Abbiamo poi caratterizzato il tasso di produzione di AI-1 su base cellulare nel tempo per ogni concentrazione di AI-2 testata tracciando una funzione logistica attraverso i dati AI-1, determinando la derivata di questa equazione nel tempo, e dividendo la derivata per la densità cellulare nel tempo (Tabella 1 supplementare) ottenendo un tasso di produzione specifico dipendente dal tempo. I grafici risultanti (Fig. 5d) mostrano il tasso stimato per cella di produzione AI-1 in funzione dell’aggiunta di AI-2 e del tempo dall’aggiunta di AI-2. Come sarà mostrato in seguito, questo si allinea con un’osservazione di fondo che abbiamo osservato che la traiettoria dell’espressione genica in risposta a un segnale iniziale è abbastanza robusto21,38,40.

In seguito, è stato testato l’effetto di AI-1 prodotto dalle cellule traduttrici PH04 sul tasso di crescita delle cellule controller AI-1 responsive. Cioè, le cellule sensibili alla crescita sono state aggiunte al CM contenente AI-1 dalle cellule traduttrici che erano state esposte a vari livelli di AI-2 e coltivate per ~ 3 ore (Fig. 4a supplementare). Al di là di quanto mostrato in Fig. 5 dove AI-1 è generato dall’esposizione diretta a AI-2, questo esperimento dimostra che la traduzione cellulare di AI-2 in AI-1 può essere fatto con l’espressione necessaria e la dinamica della coltura cellulare in modo da influenzare il tasso di crescita della seconda popolazione (Supplementary Fig. 4b). Notiamo anche che il tasso di crescita dinamica delle cellule controllori è stato mostrato diminuire nel tempo nel corso delle 3 ore successive. Questa osservazione è stata resa più drammatica in successivi esperimenti di co-cultura.

Regolazione autonoma della composizione della co-cultura

Abbiamo poi aggiunto le cellule traduttrici (indicate come popolazione A) e le cellule controllori AI-1 reattive (popolazione B) a soluzioni con una gamma di concentrazioni iniziali di AI-2. Nelle co-colture di cellule traduttrici e cellule di controllo, le cellule traduttrici regolano autonomamente la composizione dei consorzi in base al livello iniziale di AI-2. Nella Fig. 5 supplementare, le co-colture con aumento dei livelli iniziali di AI-2 hanno portato ad un aumento di AI-1 (Fig. 5b supplementare) e un corrispondente aumento dell’abbondanza relativa della popolazione B (Fig. 5a supplementare). Questi risultati hanno dimostrato il concetto di controllo autonomo mediato dal segnale della popolazione dei consorzi. È importante notare che le stime del tasso di crescita per la popolazione A e la popolazione B concordavano con i valori attesi del tasso di crescita misurati durante gli esperimenti di monocoltura (Fig. 5c supplementare).

Poi, avendo dimostrato che le cellule traduttrici potrebbero regolare la composizione dei consorzi in base all’esposizione ad AI-2, abbiamo sviluppato un modello matematico per caratterizzare le dinamiche del sistema. In questo modo, si può prevedere il comportamento della co-cultura date le condizioni iniziali specifiche, i disegni del tasso di crescita, ecc, al fine di determinare i parametri necessari per raggiungere un risultato desiderato. Questo modello matematico concettualmente semplice è stato creato per prevedere il comportamento della co-cultura utilizzando i dati dei singoli ceppi. Il modello consiste di quattro equazioni differenziali ordinarie, una per ogni densità di popolazione, concentrazione di substrato e concentrazione di AI-1 (tabelle supplementari 2 e 3). La cinetica di crescita di Monod con un coefficiente di rendimento costante è stata usata per modellare la crescita delle cellule e la concentrazione del substrato, con funzioni aggiuntive che rappresentano la produzione e/o gli effetti delle molecole QS. L’AI-1 prodotto dalla popolazione A è basato sia sul livello di esposizione AI-2 e il tempo (fAI1). Nel lavoro precedente38, abbiamo trovato che le traiettorie dipendenti dal tempo del comportamento delle cellule erano una conseguenza dell’esposizione iniziale all’autoinduttore in modo che le funzioni dipendenti dal tempo della produzione AI-1 sarebbe plausibile qui. Il tasso di crescita della popolazione B è stato formulato in base al livello prevalente di AI-1 (fHPr). I tassi di crescita specifici massimi sono stati misurati utilizzando dati sperimentali, i rendimenti sono stati stimati in base alla densità della fase stazionaria osservata sperimentalmente e alle concentrazioni iniziali note del substrato, e i valori K1 e K2 sono stati scelti in base ai valori della letteratura per il glucosio. Il solutore MATLAB (versione R2016a) ode45 è stato utilizzato per risolvere il sistema di ODE. Il modello può essere utilizzato per mostrare come si prevede che una popolazione di co-cultura cambi con il tempo date queste semplici equazioni fenomenologiche del tasso e le costanti best-fit. Come notato, questo fornisce la base per determinare se una co-cultura può anche essere prevista per evolvere nei tempi limitati disponibili in una cultura batch. È importante notare che i nostri risultati dalle monocolture sono usati per simulare i risultati sperimentali delle co-colture.

Cioè, abbiamo poi valutato il controllo della co-cultura programmato autonomamente attraverso le previsioni del modello. Le co-culture delle popolazioni A e B sono state messe insieme per una gamma di popolazioni cellulari iniziali e sono state poi aggiunte a mezzi con livelli prescritti di AI-2 per mettere in moto una traiettoria di popolazione. Nel nostro sistema, la composizione iniziale è selezionata in base al rapporto di cellule fornite nella co-cultura e poi la composizione della cultura è regolata autonomamente nel tempo in base al livello di AI-2 nei media. Abbiamo confrontato i risultati con il nostro modello. In Fig. 6, la composizione della co-cultura e il livello di AI-1 dopo 5 ore è mostrato per una varietà di condizioni tra cui variato rapporti iniziali A: B e AI-2 livello. In questi test, abbiamo usato una densità iniziale di cellule della popolazione. È importante notare che il nostro modello ha predetto bene i risultati sperimentali sia del livello di AI-1 che della composizione della co-cultura. Notiamo anche che il modello può essere utilizzato per selezionare le condizioni iniziali che danno un risultato desiderato. Per esempio, per ottenere una popolazione B con una densità cellulare relativa del 55% a 5 ore, la co-cultura potrebbe essere avviata con un rapporto iniziale A:B di 60:40 e una concentrazione di AI-2 di 40 µM. Altri scenari sono stati testati e convalidati, come illustrato. Questi risultati dimostrano chiaramente che la condizione iniziale della composizione cellulare (ad esempio, il rapporto A:B) e l’esposizione a diversi livelli di AI-2 influenzano entrambi la traiettoria della popolazione in co-cultura. Altrettanto importante, tuttavia, è che la molecola segnale ortogonale, AI-1, si è comportata come da modello. Prevediamo che, per estensione, l’inclusione di questo e di altri segnali traduttori permetterà di progettare e/o controllare ulteriori consorzi variati o più complicati.

Cioè, abbiamo testato il sistema di controllo della co-cultura con l’esposizione a una concentrazione di AI-2, 80 µM, che era superiore alle concentrazioni di AI-2 utilizzate per caratterizzare le cellule traduttrici, e per le quali non avevamo un modello. Abbiamo usato i risultati della co-cultura (Fig. 6) per stimare il comportamento delle cellule traduttrici in una monocoltura a questa concentrazione di AI-2. Abbiamo poi eseguito esperimenti di monocoltura aggiungendo 80 µM AI-2 alle cellule traduttrici e abbiamo dimostrato che eravamo in grado di prevedere il comportamento in monocoltura usando i dati di co-cultura e il modello. La Fig. 6a mostra il tasso di produzione di AI-1 previsto dai dati di co-cultura e dal modello (linea) e il tasso effettivo di produzione di AI-1 durante l’esperimento di monocoltura (punti dati). La Fig. 6b supplementare mostra i livelli previsti di AI-1 nella monocoltura nel tempo rispetto ai livelli reali misurati di AI-1. Il livello previsto di AI-1 è stato determinato utilizzando il modello, inserendo il tasso di produzione stimato di AI-1 e la densità cellulare iniziale della monocoltura.

Infine, abbiamo testato il nostro sistema di co-cultura per un periodo di tempo più lungo utilizzando l’alimentazione ripetuta in batch con aggiunte multiple AI-2 (Fig. 7). Qui, il nostro obiettivo era quello di estendere la traiettoria della popolazione oltre quella ottenuta variando la composizione iniziale e l’esposizione a un livello fisso di AI-2 in una semplice cultura batch. In questo modo, testiamo la robustezza dello schema di controllo. Ad esempio, in Fig. 6, per le culture inizialmente a ~ 40% di popolazione B, abbiamo trovato che potremmo raggiungere solo livelli di popolazione B che si avvicina al 60% e solo con l’esposizione a livelli elevati (>80 μM) di AI-2. Testando un sistema a lotti ripetuti, abbiamo pensato di poter guidare la popolazione B a oltre l’80% semplicemente risospendendo ed estendendo il sistema nel tempo. Abbiamo aggiunto la nostra co-cultura ai media con vari livelli di AI-2 e ogni 3 ore abbiamo risospeso le cellule in media freschi con ulteriore AI-2. Immediatamente prima di ogni risospensione, sono stati prelevati campioni per l’analisi della concentrazione di AI-1 e la composizione della coltura cellulare (Fig. 7a, b). La densità delle cellule e l’attività AI-2 sono stati misurati anche (Fig. 7 supplementare). Abbiamo trovato che in questo set-up sperimentale più complesso, il sistema ha generalmente funzionato come progettato. Abbiamo scoperto che con l’esposizione a quantità inferiori di AI-2 (20 e 40 μM), potremmo raggiungere quasi l’80% di popolazione B. Durante questo test, tuttavia, abbiamo scoperto che i nostri risultati sperimentali divergevano dai risultati previsti dal nostro modello matematico. Abbiamo guardato più da vicino l’AI-1 prodotto e il tasso di crescita delle culture durante ogni segmento 3 h al fine di ottenere una comprensione della dinamica della cultura basata sulla divergenza osservata con il modello semplice. Per esempio, l’AI-1 prodotto durante il secondo e il terzo ciclo di 3 ore era più alto di quanto previsto dal modello. Con il senno di poi, questo aveva senso perché le cellule, dopo il primo ciclo di batch, avevano già prodotto LasI (che sintetizza AI-1), e l’ulteriore AI-2 stava probabilmente inducendo un’ulteriore produzione di LasI (non abbiamo incluso un tag di degradazione su LasI, quindi il suo mantenimento avrebbe dovuto essere previsto). Abbiamo quindi regolato il modello in modo che il tasso di produzione di AI-1 all’inizio di ogni successiva risospensione in nuovi media fosse lo stesso che alla fine del ciclo precedente (Fig. 7c, linee solide). Incorporando queste nuove funzioni per la produzione di AI-1 nel modello si sono ottenuti valori per AI-1 che si adattano strettamente ai dati sperimentali AI-1 (Fig. 7a, modello in linee continue). Allo stesso modo, abbiamo stimato il tasso di crescita delle cellule di controllo (vedi nota supplementare 1) e abbiamo trovato che il tasso di crescita in combinazione con le concentrazioni di AI-1 non si adattava alla nostra precedente funzione fAI1 (Fig. 7d). Notiamo che per calcolare il tasso di crescita delle cellule di controllo abbiamo assunto il tasso di crescita delle cellule traduttrici è rimasto costante, anche se possono essere diminuite leggermente come risultato di ripetute aggiunte AI-2. Mentre il tasso di crescita del controllore sembrava inizialmente aumentare in funzione di AI-1, con successive risospensioni in mezzi freschi il tasso di crescita complessivo è diminuito. In precedenza avevamo notato una diminuzione dinamica del tasso di crescita su sovraespressione di HPr e LasI (Figg. 4 e 5 supplementari). Qui, sospettiamo che un carico metabolico posto sulle cellule dall’esposizione ripetuta ad alti livelli di AI-1 o una riduzione dei substrati o dei livelli di nutrienti potrebbe essere la causa della diminuzione della crescita durante i cicli successivi. Soprattutto, regolando il nostro modello in modo che l’effetto di AI-1 sul tasso di crescita è diminuito con il tempo (vedi nota supplementare 2), siamo stati in grado di adattarsi ai nostri dati sperimentali (Fig. 7b, modello regolato in linee solide) senza aggiungere complessità del modello.

In sintesi, il nostro sistema di co-cultura ha risposto come progettato se è stato posto in media senza AI-2 o con un alto livello di AI-2. Inoltre, i nostri risultati hanno mostrato densità di popolazione controllabili che andavano dal 40 all’80% delle cellule di controllo. Inoltre, il confronto con il nostro modello originale ha dato un’idea di come il sistema si è comportato in questo set-up sperimentale più complesso; le cellule traduttrici sembravano produrre livelli più elevati di AI-1 nel tempo, mentre le cellule controllori sembravano avere ridotto i cambiamenti regolati da AI-1 nel tasso di crescita nel tempo.

Infine, il modello potrebbe fornire una base per esplorare in silico come le strategie utilizzate qui per culture autonomamente regolate (contrassegnate da tasso di crescita regolato dal segnale e segnalazione nativa cellula-cellula) potrebbero essere estese ad altri sistemi, compresi i sistemi regolati dall’utente o programmabili che potrebbero essere controllati dinamicamente. Per esempio, le culture chemostat si distinguono dall’attuale sistema autonomo in quanto i loro output sono diretti da input specificati dall’utente, come il tasso di diluizione. Come primo passo, abbiamo eseguito simulazioni di co-culture coltivate in chemostato con l’aggiunta dei termini di flusso standard al modello batch (Fig. 8 supplementare, Tabelle supplementari 4 e 5). Abbiamo trovato in alcuni casi, che il tasso di diluizione definisce una composizione di coltura allo stato stazionario che, a sua volta, può essere successivamente “sintonizzata” entro un intervallo limitato dal tasso di diluizione. Il “tuning” può essere ottenuto modulando esternamente la segnalazione cellula-cellula, per esempio, mediante l’aggiunta esogena di molecole segnale. Questi casi illustrano come l’interazione tra il nostro sistema autonomo e altri sistemi controllati dall’utente potrebbe portare a traiettorie di popolazione più complesse. I nostri risultati di simulazione qui servono come quadro concettuale per controllare la composizione dei consorzi in sistemi più complessi, guidati dall’utente. Ulteriori discussioni sulle simulazioni del chemostato sono nella nota supplementare 3.

.