Elisabetta sposò Filippo II di Spagna figlio di Carlo V, imperatore del Sacro Romano Impero, e di Isabella del Portogallo nel 1559. Originariamente sposata per procura a Notre Dame (con il duca d’Alba che sostituiva Filippo) prima di lasciare la Francia, la cerimonia effettiva ebbe luogo a Guadalajara, Spagna, al suo arrivo. Il matrimonio fu un risultato della Pace di Cateau Cambrésis (1559). La sua seconda moglie, Maria I d’Inghilterra, era morta da poco, rendendo Elisabetta di Valois la terza moglie di Filippo.
Al suo matrimonio incontrò il pittore Sofonisba Anguissola, e Ana de Mendoza, che avrebbe vissuto con lei per il resto della sua vita. Filippo II nominò Anguissola come dama di compagnia e pittore di corte della sua regina. Sotto la tutela di Anguissola, Elisabetta migliorò le sue capacità pittoriche amatoriali. Anguissola influenzò anche le opere artistiche dei suoi figli, Isabella Clara Eugenia e Caterina Michaela, durante la sua permanenza a corte.
Filippo era completamente incantato dalla sua sposa quattordicenne, e dal 1564 aveva rinunciato alle sue infedeltà. Nonostante la notevole differenza d’età, anche Elisabetta era abbastanza soddisfatta del marito (nelle lettere alla madre, si proclamava fortunata di aver sposato un principe così affascinante). Filippo si divertiva a organizzare tornei cavallereschi per intrattenere la moglie. Elisabetta faceva da dama di compagnia ai tre giovani principi della corte spagnola: Carlos, principe delle Asturie, Giovanni d’Austria (figlio illegittimo di Carlo V), e Alessandro Farnese, duca di Parma (figlio della figlia illegittima di Carlo V, Margherita).
Elisabetta era stata originariamente promessa al figlio di Filippo, Carlos, principe delle Asturie, ma complicazioni politiche resero necessario un matrimonio con Filippo. Il suo rapporto con il travagliato figliastro Carlos era caldo e amichevole. Nonostante i rapporti sul suo comportamento progressivamente bizzarro, Carlos fu sempre gentile e premuroso con Elisabetta. Quando alla fine fu necessario che Filippo lo rinchiudesse (il che portò di lì a poco alla morte del principe), Elisabetta pianse per giorni.
Filippo era molto legato ad Elisabetta, restandole vicino anche quando era malata di vaiolo. La prima gravidanza di Elisabetta nel 1560 ebbe come risultato un figlio nato morto, seguito nel 1564 da un aborto di due gemelle. Successivamente diede alla luce l’Infanta Isabella Clara Eugenia di Spagna il 12 agosto 1566, e poi la sorella minore di Isabella, Caterina Michelle di Spagna, il 10 ottobre 1567. Filippo ed Elisabetta erano molto vicini ad entrambe le loro figlie, comprando loro marmellate, bambole, giocattoli e altro. Si dice che “entrambi si rallegrarono della nascita di Isabella come se fosse stata la nascita di un figlio”. Elisabetta ebbe un altro aborto spontaneo il 3 ottobre 1568, e morì lo stesso giorno, insieme alla figlia neonata.
Dopo la morte di Elisabetta, Caterina de’ Medici offrì la sua figlia minore Margherita come sposa per Filippo. Filippo rifiutò l’offerta.