FLAG-tag

FLAG-tag, o ottapeptide FLAG, o epitopo FLAG, è un tag proteico polipeptidico che può essere aggiunto a una proteina utilizzando la tecnologia del DNA ricombinante, avente il motivo di sequenza DYKDDDDK (dove D=acido aspartico, Y=tirosina, e K=lisina). È uno dei tag più specifici ed è un antigene artificiale per il quale sono stati sviluppati anticorpi monoclonali specifici ad alta affinità e quindi può essere utilizzato per la purificazione delle proteine mediante cromatografia di affinità e può anche essere utilizzato per localizzare le proteine all’interno delle cellule viventi. È stato usato per separare la proteina ricombinante e sovraespressa dalla proteina wild-type espressa dall’organismo ospite. Può anche essere usato nell’isolamento di complessi proteici con subunità multiple, perché la sua procedura di purificazione delicata tende a non interrompere tali complessi. È stato usato per ottenere proteine di purezza e qualità sufficienti per effettuare la determinazione della struttura 3D tramite cristallografia a raggi X.

Un FLAG-tag può essere usato in molti saggi diversi che richiedono il riconoscimento da parte di un anticorpo. Se non esiste un anticorpo contro una data proteina, l’aggiunta di un FLAG-tag a una proteina permette di studiare la proteina con un anticorpo contro la sequenza FLAG. Esempi sono gli studi di localizzazione cellulare tramite immunofluorescenza, immunoprecipitazione o rilevamento tramite elettroforesi proteica SDS PAGE e Western blotting.

La sequenza peptidica del FLAG-tag dal N-terminale al C-terminale è: DYKDDDDK (1012 Da). Inoltre, può essere utilizzato in tandem, comunemente il peptide 3xFLAG: DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK (con il tag finale che codifica un sito di scissione dell’enterokinasi). Può essere fuso al C-terminale o all’N-terminale di una proteina, o inserito all’interno di una proteina. Alcuni anticorpi disponibili in commercio (ad esempio, M1/4E11) riconoscono l’epitopo solo quando è presente al N-terminale. Tuttavia, altri anticorpi disponibili (per esempio, M2) sono insensibili alla posizione. Il residuo di tirosina nel FLAG-tag può essere solfatato, che può influenzare il riconoscimento anticorpale dell’epitopo FLAG. Il FLAG-tag può essere usato insieme ad altri tag di affinità, per esempio un tag polistidina (His-tag), HA-tag o myc-tag.

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