Il cDNA è a singolo o doppio filamento? – (Feb/09/2006 )

Salve,
Ho postato la mia domanda altrove ma non ho avuto risposta, vorrei postarla qui e, scusate se sembra una domanda stupida, perché sono davvero confuso !
Ho letto da qualche parte una cosa che mi ha lasciato perplesso sul cDNA. Vorrei sapere se il cDNA è un doppio filamento o un filamento singolo?
So che il cDNA è la copia dell’mRNA tramite trascrittasi inversa quindi, teoricamente, sarebbe un filamento singolo, giusto o mi sbaglio?
Grazie per il vostro feedback

Per la maggior parte dei casi, come per RT-PCR, 3′ o 5′ RACE, usiamo solo cDNA a singolo filamento (il primo filamento cDNA), mentre in caso di preparazione del cDNA per la costruzione della libreria, o l’analisi RDA/SSH che potrebbe avere bisogno di un ulteriore passo di sintesi del secondo filamento per generare cDNA a doppio filamento.

hi
devi differenziare 2 cose:
cDNA in generale è la molecola di DNA che corrisponde approssimativamente alla seuqenza dell’mRNA. Quindi è una molecola a doppio filamento inclusa nel plasmide per l’espressione nella maggior parte dei casi.
RT PCR: la molecola di mRNA è trascritta inversa in cDNA a filamento singolo. Dopo questo punto, la RNasi elimina la molecola di mRNA e si ottiene una molecola di cDNA a filamento singolo. Poiché il passo successivo è una PCR abbastanza classica, un singolo filamento va bene per l’exp (e il primo passo, che corrisponde alla sistesi del secondo filamento corrispondente di una molecola di DNA ripristina la vera molecola di cDNA.
Per essere giusti, il cDNA è una molecola a doppio filamento, ma per comodità, il cDNA è anche usato per disegnare la molecola trascritta inversa della RTPCR. Dovrebbe essere nominato come mezzo cDNA o cDNA a singolo filamento.
cDNA è un nome abbreviato.

mentre nella maggior parte dei casi, cDNA, abbreviazione di DNA complementare, è definito come una molecola di DNA a singolo filamento con una sequenza nucleotidica che è complementare a una molecola di RNA, e viene sintetizzata in laboratorio da mRNA mediante trascrizione inversa…

Quindi, il cDNA è a singolo filamento finché non viene effettuata una reazione PCR? Ok, in questo caso, come fa la Taq DNA Polymerase a generare un secondo filamento complementare da uno solo ? Quando i due primer si annebbiano su ogni lato dello stesso filamento, come possono produrre il secondo filamento (il nuovo complementare) ?

Nella PCR un primer si lega ad un pezzo di DNA a singolo filamento (ecco perché il primo passo è sempre quello di dentare a 94C (o giù di lì) per separare le molecole a doppio filamento in filamenti singoli. Nel caso del primo filamento di cDNA di una reazione RT solo un primer si lega al primo turno… Questo significa che il primo round di amplificazione in una RT-PCR non è logaritmico: si sintetizza semplicemente il secondo filamento di cDNA. Nei round successivi (dal round 2 al round n) c’è amplificazione logritmica perché entrambi i primer forward e reverse si legano al template denaturato a doppio filamento.
Nel primo round, penso che sia il primer forward a legarsi… Penso che questo sia perché mRNA=filo anteriore nel genoma e il primo filamento cDNA=complemento dell’mRNA (o è lo stesso del filamento inverso nel genoma)
Qualcuno controlli la mia logica qui, mi sto confondendo… è giusto che l’mRNA sia il complemento del filamento inverso del DNA genomico?
e: sequenza mRNA=filo inverso=5′-3′ sequenza nel gDNA (solo con U non T)???
HTH

Grazie a tutti, ora è più chiaro per me.

Penso di sì, finché non si incontra un introne, giusto?
Possiamo controllare qualsiasi sequenza di mRNA nota in NCBI, recuperare il colpo genomico e confrontare le sequenze per vedere se è vero o no.

Sì, è vero, dovresti saltare gli introni
Sembra un buon modo per testare, proverò più tardi se ne avrò la possibilità e ti farò sapere… più ci penso, la sequenza mRNA = sequenza del filamento anteriore deve essere giusta però…
Grazie!