Giugno 1, 2016 (Vol. 36, No. 11)
DeeAnn Visk Ph.D. Founder and Principal Writer DeeAnn Visk Consulting
Gene Therapy Must Breach Cellular Ramparts without Reenacting the Fall of Jericho in Miniature
Immunoterapie contro il cancro, vaccini contro nuovi virus (o vecchi virus in nuovi luoghi), e tentativi di risolvere i difetti patogeni delle singole cellule – tutti stanno cercando di incorporare la tecnologia di trasfezione. Questa tecnologia, che comprende vari mezzi per introdurre acidi nucleici nelle cellule, è molto promettente, ma pone anche serie sfide.
Queste sfide sono state più importanti nei tentativi di implementare la terapia genica, che ha avuto difficoltà ad affrontare il problema delle cellule, degli organi e degli animali interi difficili da trasporre.
Tali sfide di trasfezione sono state raccolte da diverse aziende biotecnologiche. Per esempio, MaxCyte, Lonza e Mirus Bio offrono l’elettroporazione come metodo che lascia pochi residui. L’elettroporazione, succede, non è adatta all’uso con tutti gli animali, quindi sono necessari altri metodi. Una tecnica alternativa è l’infezione virale. Viene impiegata da aziende come GenVec.
Un’altra sfida, particolarmente rilevante per la trasfezione virale, è la possibilità di stimolare una risposta immunitaria. Questo potenziale negativo può essere un vero positivo, tuttavia, nel giusto contesto, che è lo sviluppo di un vaccino. Sfruttare gli approcci di trasfezione virale per alimentare i meccanismi di vaccinazione è una specialità di Thermo Fisher Scientific. L’azienda offre anche la trasfezione tradizionale a base chimica che funziona in tutto l’animale.
Insieme, le aziende menzionate finora offrono tecnologie che coprono tutte le principali modalità di trasfezione terapeuticamente rilevanti: trasfezione a base chimica, metodi non chimici (principalmente elettroporazione), e trasduzione virale. Si stanno sviluppando anche approcci ibridi, come diventerà chiaro nelle sezioni seguenti.
Elettroporazione
La piattaforma di elettroporazione di MaxCyte è conforme alle GMP e perfettamente scalabile dalla ricerca alla scala commerciale. “Il nostro sistema di elettroporazione a flusso permette di trasfettare da un milione a diverse centinaia di miliardi di cellule in meno di 30 minuti in un sistema chiuso completamente automatizzato”, spiega Madhusudan V. Peshwa, Ph.D., CSO. “Il nostro sistema è conforme alle norme ISO 9000 e FDA, quindi può facilmente soddisfare le esigenze di produzione a livello terapeutico.
“Collaboriamo abitualmente con aziende farmaceutiche e biotecnologiche per sviluppare terapie con cellule staminali e immunitarie ex vivo. A volte l’obiettivo è quello di produrre rapidamente vaccini e farmaci biologici ad alto rendimento come gli anticorpi. Altre volte, permettiamo ai clienti di creare una produzione su larga scala ad alto titolo di vettori virali utilizzando cellule in sospensione e aderenti. Questo non solo aiuta lo sviluppo terapeutico, ma può anche accelerare le applicazioni di scoperta della droga.”
Questa capacità di elaborare le cellule in grandi o piccoli numeri permette agli scienziati al banco di sviluppare un protocollo di processo utilizzando l’elettroporazione a flusso per piccoli numeri di cellule. L’aumento di scala di questo processo è poi senza soluzione di continuità senza i soliti mal di testa di mantenere la qualità, poiché il processo di trasfezione rimane lo stesso.
“Questa riduzione del rischio è molto interessante per i nostri partner. Garantire la coerenza dalla ricerca, alla clinica, alla scala commerciale e da un’esecuzione all’altra, da donatore a donatore e da paziente a paziente è fondamentale per guidare in modo efficiente le terapie attraverso il processo di sviluppo”, afferma il dottor Peshwa.
Mentre gli approcci chimici e lipidici funzionano bene nella ricerca con linee cellulari stabilite, ci sono spesso conseguenze impreviste della trasfezione di cellule primarie. Inoltre, questi mezzi chimici tradizionali di trasfezione delle cellule sono difficili da scalare fino alla produzione industriale.
L’elettroporazione, l’approccio non virale impiegato da MaxCyte, permette alla biologia delle cellule trasfettate di rimanere in uno stato più naturale in qualsiasi scala. Impedendo conseguenze indesiderate durante il processo di trasfezione, la tecnologia di MaxCyte può evitare di creare blocchi stradali, risolvendo al contempo la necessità di un’elevata efficienza di trasfezione.
“Questi interventi terapeutici devono essere virtualmente garantiti per avere un minimo impatto negativo indesiderato sulle cellule modificate – tutta la biologia deve essere la stessa durante ogni fase del processo”, insiste il dottor Peshwa. “Inoltre, il nostro sistema di elettroporazione a flusso può essere utilizzato in modo automatizzato. È già utilizzato di routine in Giappone per trattamenti terapeutici commerciali ed è in varie fasi di adozione in tutto il mondo.”
Un’altra considerazione è dove avviene la trasfezione. Le cellule raccolte da un paziente vengono trasportate in un’altra città per la lavorazione? Cosa succede quando un pacchetto viene perso, o ritardato, o sperimenta fluttuazioni di temperatura? La piattaforma offerta da MaxCyte offre l’opportunità di sviluppare nuove terapie attraverso la lavorazione in loco delle cellule dei pazienti, aggirando i principali problemi logistici e di COGS (costo dei beni venduti) di altri metodi.
L’ingegnerizzazione delle cellule è fondamentale per lo sviluppo di terapie basate sulle cellule. Il sistema di elettroporazione di MaxCyte può evitare la modifica involontaria del fenotipo cellulare mentre soddisfa le esigenze chiave delle sfide di ingegneria cellulare: efficienza, coerenza, portabilità e scalabilità, secondo l’azienda.
Trasduzioni virali
I vettori virali sono particolarmente utili per la tranfezione dell’intero animale o per l’uso con tessuti che possono essere difficili da raggiungere tramite approcci chimici o di elettroporazione. GenVec è specializzata nell’uso di vettori virali, in particolare l’adenovirus, per fornire geni a fini terapeutici.
“A prima vista, i problemi associati alla risposta immunitaria ai vettori virali sembrano essere problematici”, spiega Doug Brough, Ph.D. “Tuttavia, abbiamo scoperto che questo può essere utilizzato per stimolare una risposta immunitaria a materiali estranei, in modo tale che gli adenovirus potrebbero essere impiegati per fornire vaccini”
Infatti, GenVec ha studiato a fondo l’adenovirus e generato diversi “sapori” di adenovirus. Quando si esplorano gli adenovirus in altre specie, come le specie di gorilla e di scimmie, i ricercatori possono utilizzare vettori che sono progettati per evitare l’immunità preesistente che la popolazione umana generale ha agli adenovirus.
“La grande libreria di vettori offerta da GenVec è chiamata Adenoverse™”, informa il dottor Brough. “Abbiamo eliminato ampie sezioni dell’adenovirus per limitare la tossicità innata associata al trattamento con adenovirus. Oltre a prevenire una risposta immunitaria deleteria al vettore, questo ci permette di inserire fino a 12 kb nel virus.”
Utilizzando una varietà di approcci, GenVec ha lavorato con un certo numero di aziende su diverse applicazioni, terapie di acido nucleico e tecnologie di editing genico. Gli adenovirus modificati possono fornire approcci con le dita di zinco, sia in vitro che in vivo.
Un esempio di una di queste collaborazioni si trova con la sperimentazione clinica Novartis per rigenerare le cellule sensoriali nell’orecchio interno. “Infettando le cellule dell’orecchio interno con un gene che codifica una proteina regolatrice chiave, nuove cellule meccanosensoriali possono essere generate per sostituire quelle perse a causa di lesioni o condizioni genetiche intrinseche”, spiega il dottor Brough.
Altri progetti comuni si possono trovare con le partnership in entità per trattare il cancro e sviluppare vaccini. “Quando arriva il momento di commercializzare una tecnologia, GenVec utilizza una linea cellulare precedentemente approvata dalla FDA per queste applicazioni”, chiarisce il Dr. Brough.
“Un altro vantaggio evidente dell’uso degli adenovirus è che possono trasfettare facilmente animali interi. Per esempio, una malattia devastante negli animali da allevamento, chiamata afta epizootica, è perpetuata da una varietà di virotipi. Il nostro sistema potrebbe consentire il rapido scambio di qualsiasi ceppo che sta causando un’epidemia e permettere di fornire rapidamente un vaccino su misura”, descrive il dottor Brough.
Nucleofection
Lonza offre una forma avanzata di elettroporazione chiamata Nucleofection™, che utilizza soluzioni di trasfezione specifiche per il tipo di cellula accoppiate a un sistema di consegna a impulsi più sfumato che consente la trasfezione di molti tipi diversi di cellule, in particolare le normali cellule umane primarie.
“Invece di utilizzare soluzioni tampone standard di elettroporazione, utilizziamo soluzioni di trasfezione specifiche per il tipo di cellula”, dice Gregory Alberts, Ph.D, un esperto globale in materia presso Lonza. “Questo ci permette di stabilizzare i pori generati durante la consegna degli impulsi. Noi ipotizziamo che i pori formati nella membrana cellulare durante l’elettroporazione standard si chiudano rapidamente. La nostra tecnologia stabilizza i pori formati dall’elettroporazione e permette al materiale di diffondersi nella cellula e, più specificamente, nel nucleo della cellula.”
L’approccio Nucleofection utilizza molti substrati diversi: DNA, mRNA, siRNA, peptidi, proteine e piccole molecole. Le efficienze di trasfezione per siRNA e mRNA sono molto buone, meglio del 90%. I piccoli peptidi di solito trasfettano con circa l’80% di efficienza, e le efficienze per il DNA plasmidico sono ovunque dal 50% al 90%, a seconda del tipo di cellula. Anche i grandi substrati, le proteine più grandi come gli anticorpi o i cromosomi artificiali batterici (BAC), possono entrare nelle cellule bersaglio con efficienze di trasfezione ragionevolmente efficaci.
“La nucleofezione è sorprendentemente flessibile”, dichiara il dottor Alberts. “È stata usata per trasfettare tutti i tipi di cellule umane primarie. È stata usata nella generazione di iPSC (cellule staminali pluripotenti indotte), nella trasfezione di CRISPR e di altri substrati di genoma-editing, così come nella trasfezione di obiettivi più esotici come la famiglia di parassiti Plasmodium che causano la malaria. Altri organismi simili possono anche essere trasfettati con Nucleofection per consentire la ricerca sulle malattie tropicali.”
La piattaforma Nucleofection è scalabile. Per esempio, il sistema Nucleofection ad alta produttività può gestire formati da 96 e 384 pozzetti. Spesso questo sistema sarà impiegato in una struttura di screening di base. Gli scienziati al banco possono usare il Nucleofector 4D a bassa produttività per ottimizzare le condizioni del test. Poiché il Nucleofector 4D da banco utilizza le stesse condizioni di trasfezione, lavora con lo stesso numero di cellule e fornisce le stesse prestazioni dei dispositivi a più alto rendimento, quando è il momento di passare a una scala più grande, il test non richiede una nuova ottimizzazione.
“La continuità del sistema permette di confrontare le mele con le mele mentre si scala il progetto su o giù”, illustra il dottor Alberts.
“Siamo nel processo di beta testing di un nuovo dispositivo di trasfezione di grande volume che sarà in grado di trasfettare da 200 milioni a 1 miliardo di cellule in un formato che va da 1 a 20 mL. I risultati preliminari mostrano che il dispositivo trasfetta cellule umane primarie o linee cellulari agli stessi livelli degli altri dispositivi Lonza Nucleofector”, continua il dottor Alberts. “Questo prodotto sarà rilasciato solo per scopi di ricerca, anche se a causa della capacità di Nucleofection di trasfettare così bene le cellule umane primarie, ci sarà senza dubbio interesse nell’uso di questo dispositivo in applicazioni più orientate alla clinica.”
Il dott. Alberts prevede che Nucleofection possa svolgere un ruolo nelle terapie innovative e personalizzate contro il cancro, come la terapia con cellule T di antigene chimerico (CAR-T), così come altre terapie basate su cellule che richiedono la trasfezione o la modifica genomica di cellule umane primarie.
“La capacità di Nucleofection di trasfettare facilmente ed efficacemente le cellule T umane primarie attirerà l’attenzione negli approcci di terapia genica per trattare le malattie. L’approccio di Lonza alle potenziali applicazioni di terapia genica
ha anche un ingombro molto ridotto. Questo è fondamentale perché il macchinario ‘residuo’ di altre tecniche di trasfezione può portare a conseguenze biologiche indesiderate”, conclude il dottor Alberts.
Gli scienziati di Lonza hanno valutato la capacità della tecnologia Nucleofection dell’azienda di trasfettare cellule muscolari lisce aortiche di ratto adulto dissociate (AoSMC). Le AoSMC di ratto crioconservate sono state scongelate e coltivate per sette giorni in piastre da 24 pozzetti e le cellule sono state trasfettate in aderenza utilizzando la soluzione AD1 4D-Nucleofector Y. Ventiquattro ore dopo la trasfezione, le cellule sono state fissate e analizzate. L’actina è mostrata in rosso; GFP, in verde.
Formulazioni
Mirus Bio sviluppa e produce nuove formulazioni di trasfezione, che consentono la consegna ad alta efficienza e bassa tossicità di molti diversi tipi di molecole di acido nucleico. Molte delle formulazioni sono prive di componenti di origine animale. “Il sistema CRISPR richiede la consegna di un RNA guida (gRNA) e l’espressione dell’endonucleasi Cas9, che può essere sotto forma di proteina, mRNA o DNA. Mirus Bio offre soluzioni di trasfezione per supportare la consegna efficace di tutte le diverse molecole codificanti Cas9. Quando si usano metodi di trasfezione chimica per la consegna della proteina Cas9, i ricercatori possono usare livelli molto più bassi di proteina se questa è precomplessata con il gRNA.
“Alcuni tipi di cellule difficili da trasfezionare hanno un’efficienza di scissione più alta con la trasfezione della proteina Cas9 complessa all’interno del complesso RNP (ribonucleoproteina)”, afferma Laura Juckem, Ph.D., capogruppo R&D di Mirus Bio. “Il Mirus TransIT-X2® Dynamic Delivery System consegna efficacemente i complessi RNP e consente di utilizzare concentrazioni inferiori di proteina Cas9 rispetto all’elettroporazione.”
Un’altra sfida che le aziende devono affrontare è il passaggio dalle colture aderenti a quelle in sospensione per accogliere la grande quantità di materiale necessaria per gli studi clinici. Questo è particolarmente vero per la produzione di lentivirus ricombinanti e virus adeno-associati (AAV). “Lavoriamo a stretto contatto con i nostri clienti per garantire che le loro trasfezioni abbiano successo e che i cambiamenti nel loro flusso di lavoro diano ancora un prodotto di alta qualità”, spiega il Dr. Juckem.
“Per la terapia basata sulle cellule, il sistema di espressione CHO-gro® è stato sviluppato per dare alte rese di proteine bioterapeutiche in cellule CHO in sospensione. Questo sistema ottimizzato promuove una crescita cellulare ad alta densità e permette ai ricercatori di ottenere proteine sufficienti per eseguire studi preclinici e analisi iniziali di caratterizzazione”, conclude il dottor Juckem.
Questa immagine, tratta da una presentazione di Mirus Bio che descrive la trasfezione ad alta efficienza delle cellule staminali, indica che le cellule somatiche come i fibroblasti adulti possono essere trasfettate o trasdotte attraverso diversi metodi con una combinazione di fattori di trascrizione. Una volta che le cellule sono state riprogrammate a uno stato pluripotente, possono essere guidate a diversi destini attraverso l’aggiunta di fattori di crescita e/o la trasfezione di marcatori di selezione guidati da promotori specifici per il tipo di cellula. L’immagine sottolinea che i reagenti di trasfezione possono essere aggiunti al flusso di lavoro delle cellule staminali in diversi punti.
Approcci animali completi
Thermo Fisher Scientific è al passo con le esigenze dei clienti di generare dati biologicamente più rilevanti utilizzando cellule primarie, piuttosto che linee cellulari immortalizzate. Le cellule primarie sono tradizionalmente più difficili da trasfettare con metodi chimici. Tuttavia, i dati generati dalle colture cellulari primarie tendono a fornire risposte che si traducono meglio in modelli di animali interi in vivo.
I modelli di colture cellulari tridimensionali, che danno risultati più pertinenti rispetto alle colture cellulari bidimensionali, sono più difficili da trasfettare con i metodi tradizionali.
“La trasfezione di colture primarie con DNA è impegnativa. L’utilizzo di siRNA (piccolo acido ribonucleico inibitorio), mRNA (RNA messaggero) e proteine direttamente è più facilmente accettato dalle cellule primarie, poiché questi composti devono essere consegnati solo al citoplasma e non al nucleo delle cellule”, afferma Xavier de Mollerat du Jeu, Ph.D, direttore della R&D alla Thermo Fisher Scientific.
“La consegna al nucleo avviene quando le cellule si dividono”, continua il dottor de Mollerat “Poiché le cellule primarie non si dividono così facilmente come le linee cellulari, possiamo aggirare il problema consegnando le molecole al citoplasma piuttosto che al nucleo.”
Continuando la ricerca di sistemi biologicamente più rilevanti in animali interi, “abbiamo scoperto che l’uso in vivo di Invivofectamine® 3.0 può effettivamente abbattere l’espressione di una proteina del 90% nelle cellule del fegato”, articola il dottor de Mollerat. “Questo uso in vivo dell’Invivofectamine offre agli scienziati un modello più efficace di come si presentano i trattamenti nell’intero animale.”
Un’altra applicazione della tecnologia di trasfezione è lo sviluppo di vaccini. La tempistica per lo sviluppo di vaccini può essere accorciata immensamente usando mRNA trasfettati per esprimere antigeni contro cui il corpo può sviluppare una risposta immunitaria. Dato il numero di nuovi virus che si trovano nel mondo come Zika e chikungunya, avere la capacità di sviluppare rapidamente i vaccini migliorerà notevolmente la salute mondiale.
Con il continuo sviluppo di terapie immunitarie contro i tumori, le cellule T sono spesso bersaglio di recettori specifici. “Abbiamo lavorato con aziende interessate a sviluppare queste terapie”, spiega il dottor de Mollerat. “Lavoriamo a stretto contatto con le aziende per affrontare le questioni di come produrre questi trattamenti, fare questi trattamenti in larga scala e renderli disponibili in tutto il mondo.”
Invivofectamine 3.0 è un reagente fornito da Thermo Fisher Scientific per la consegna di RNAi in vivo. Secondo l’azienda, una singola iniezione provoca un knockdown significativo al giorno 1 e fino a 3 settimane. Questo risultato è emerso da uno studio in cui il reagente è stato iniettato nella coda di un roditore a varie dosi (1, 0,5 e 0,25 mg/kg). Il siero è stato raccolto nei giorni 2, 5, 9, 16, 23 e 30 e il siero è stato analizzato per l’abbattimento della proteina FVII mediante un test cromogenico. L’azienda ha notato che quantità più elevate di siRNA nei complessi iniettati hanno portato a un abbattimento più duraturo nell’intervallo testato.